支原體染色檢測(cè)試劑盒操作步驟

產(chǎn)品名稱：支原體染色檢測(cè)試劑盒
規(guī)格：100T
保存條件：—20℃,避光,12個(gè)月
用途：通過染色檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中是否存在支原體污染。
注意事項(xiàng)：通過Hoechst染色來(lái)檢測(cè)支原體的。本試劑盒的熒光染色可快速、有效、高靈敏度地檢測(cè)支原體污染。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
支原體染色檢測(cè)試劑盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一種經(jīng)典的利用 DNA 熒光染色法檢測(cè)支原體污染的試劑盒，其原理在于。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮，Hoechst33258 染色后在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。

Hoechst Staining Kit 經(jīng)常用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞以及組織切片的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。該試劑盒檢測(cè)細(xì)胞含量范圍一般為 0.1～1×106 之間。

自備材料：
1、 可觀察藍(lán)光的熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡
2、 PBS 或生理鹽水
3、 載玻片、蓋玻片
4、 預(yù)冷固定液：預(yù)冷的 70%乙醇或 4%多聚甲醛
 
操作步驟(僅供參考)：
(一)貼壁細(xì)胞
1、取潔凈蓋玻片在 70%乙醇中浸泡 5 分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用無(wú)菌的 PBS
或生理鹽水洗滌 3 次，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌 1 次。將蓋玻片置于 6 孔板或其他培養(yǎng)皿內(nèi)，接種細(xì)胞培養(yǎng)過夜，使融合率約為 50%～80%。
2、加入干預(yù)條件使細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入 Hoechst 固定液 0.5ml，固定 10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可 4℃過夜)。
3、去除固定液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)。
4、加入 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5min。也宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
5、棄染色液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)。
6、滴一滴抗熒封片劑于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片劑，盡量避免氣泡。
7、熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng) 350nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng) 460nm 左右。

(二)懸浮細(xì)胞
1、離心收集細(xì)胞樣品于 1.5ml 離心管內(nèi)并棄液，加入 Hoechst 固定液 0.5ml，緩緩懸起細(xì)胞，固定 10min 或更長(zhǎng)時(shí)間(亦可 4℃過夜)。
2、低速離心去除固定液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min。洗滌時(shí)手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
3、低速離心離心后吸去大部分液體保留約 50μl 液體，再緩緩懸起細(xì)胞，滴加至載玻片上，盡量使細(xì)胞分布均勻。

4、稍晾干，使細(xì)胞貼在載玻片上不易隨液體流動(dòng)。
5、均勻滴上 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5 分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干。
6、棄染色液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)。
7、滴一滴抗熒光封片劑于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
8、熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。 激發(fā)波長(zhǎng) 350nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng) 460nm 左右。

(三)組織切片
1、常規(guī)包埋切片。
2、用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min。洗滌時(shí)手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。
3、均勻滴上 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5 分鐘。
4、棄染色液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床，或手動(dòng)晃動(dòng)。
7、將切片置于載玻片上，滴一滴抗熒光封片劑，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
8、熒光顯微鏡可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng) 350nm 左右，發(fā)射波長(zhǎng) 460nm 左右。
 
注意事項(xiàng)：
1、 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測(cè)。使用抗熒封片劑時(shí)也應(yīng)避光操作。
2、 在為了獲得細(xì)胞沉淀的離心的過程中，對(duì)于特殊細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)提高離心力或延長(zhǎng)離心時(shí)間。
3、 Hoechst 33258 染色液對(duì)人體有一定刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。
4、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 
有效期： 12 個(gè)月有效。亦可 4℃保存, 1 個(gè)月有效。