支原體染色檢測試劑盒操作步驟

產(chǎn)品名稱：支原體染色檢測試劑盒
規(guī)格：100T
保存條件：—20℃,避光,12個月
用途：通過染色檢測培養(yǎng)細胞中是否存在支原體污染。
注意事項：通過Hoechst染色來檢測支原體的。本試劑盒的熒光染色可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染。

產(chǎn)品簡介：
支原體染色檢測試劑盒(Mycoplasma Stain Assay Kit)是一種經(jīng)典的利用 DNA 熒光染色法檢測支原體污染的試劑盒，其原理在于。當細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮，Hoechst33258 染色后在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。

Hoechst Staining Kit 經(jīng)常用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細胞以及組織切片的細胞凋亡檢測。該試劑盒檢測細胞含量范圍一般為 0.1～1×106 之間。

自備材料：
1、 可觀察藍光的熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡
2、 PBS 或生理鹽水
3、 載玻片、蓋玻片
4、 預(yù)冷固定液：預(yù)冷的 70%乙醇或 4%多聚甲醛
 
操作步驟(僅供參考)：
(一)貼壁細胞
1、取潔凈蓋玻片在 70%乙醇中浸泡 5 分鐘或更長時間，無菌超凈臺內(nèi)吹干或用無菌的 PBS
或生理鹽水洗滌 3 次，再用細胞培養(yǎng)液洗滌 1 次。將蓋玻片置于 6 孔板或其他培養(yǎng)皿內(nèi)，接種細胞培養(yǎng)過夜，使融合率約為 50%～80%。
2、加入干預(yù)條件使細胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入 Hoechst 固定液 0.5ml，固定 10分鐘或更長時間(可 4℃過夜)。
3、去除固定液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。
4、加入 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5min。也宜用搖床，或手動晃動數(shù)次。
5、棄染色液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。
6、滴一滴抗熒封片劑于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片劑，盡量避免氣泡。
7、熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長 350nm 左右，發(fā)射波長 460nm 左右。

(二)懸浮細胞
1、離心收集細胞樣品于 1.5ml 離心管內(nèi)并棄液，加入 Hoechst 固定液 0.5ml，緩緩懸起細胞，固定 10min 或更長時間(亦可 4℃過夜)。
2、低速離心去除固定液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min。洗滌時手動晃動數(shù)次。
3、低速離心離心后吸去大部分液體保留約 50μl 液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，盡量使細胞分布均勻。

4、稍晾干，使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動。
5、均勻滴上 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5 分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干。
6、棄染色液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。
7、滴一滴抗熒光封片劑于載玻片上，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
8、熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。 激發(fā)波長 350nm 左右，發(fā)射波長 460nm 左右。

(三)組織切片
1、常規(guī)包埋切片。
2、用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min。洗滌時手動晃動數(shù)次。
3、均勻滴上 Hoechst 33258 染色液 0.5ml，孵育 5 分鐘。
4、棄染色液，用 PBS 或生理鹽水洗 2 次，每次 3min，吸盡液體。洗滌時宜用搖床，或手動晃動。
7、將切片置于載玻片上，滴一滴抗熒光封片劑，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。
8、熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長 350nm 左右，發(fā)射波長 460nm 左右。
 
注意事項：
1、 熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。使用抗熒封片劑時也應(yīng)避光操作。
2、 在為了獲得細胞沉淀的離心的過程中，對于特殊細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當提高離心力或延長離心時間。
3、 Hoechst 33258 染色液對人體有一定刺激性，請注意適當防護。
4、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
 
有效期： 12 個月有效。亦可 4℃保存, 1 個月有效。