多酚氧化酶(PPO)提取試劑實驗原理

中文名稱:多酚氧化酶(PPO)提取試劑

儲存條件：4℃，12個月

產(chǎn)品規(guī)格：500ml

產(chǎn)品用途：主要用于裂解植物組織，提取樣品中的多酚氧化酶

簡介：多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是自然界中分布極廣的一種金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中，甚至在土壤中腐爛的植物殘渣上都可以檢測到多酚氧化酶的活性，多酚氧化酶是一種蛋白體，在茶樹生命活動和茶葉加工過程中參與一系列由酶促活動而引起的化學變化，故又被稱為生物催化劑。該酶屬于細胞木質(zhì)素合成途徑中間的關鍵酶，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

一、原理與目的

多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類物質(zhì)對微生物有毒害作用，所以傷口醌類物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應，因而受傷組織一般這種酶的活性就會提高。多酚氧化酶也可與細胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。

PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡合物而導致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標之一。

本實驗將采用馬鈴薯為主要材料，通過組織細胞破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。

通過本項實驗，學習和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關儀器設備的操作使用，以及蛋白質(zhì)的提取、分離的系統(tǒng)技術。

二、材料與試劑

（1）馬鈴薯（大約每小組100-200g）

（2）試劑：

0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制時配×10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置時配

（3）實驗器械與儀器設備：

試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；

過濾紗布；植物組織勻漿器；pH計和pH試紙；GL-20C高速冷凍離心機；

DL-7A大容量低速冷凍離心機

三、操作步驟

1：粗酶提取：

水果肉組織按1：1（W/V）比例與003M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，勻漿4層后紗布過濾，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉淀獲得酶提取液。

2：鹽析分級沉淀：

在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達到40%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），然后6000rpm離心20min棄除沉淀；離心上清液在加入固體硫酸銨達到70%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），再以6000rpm離心20min，棄除上清夜，收集粗酶沉淀。

四、實驗結(jié)果

獲得PPO粗酶液。