植物愈傷組織培養(yǎng)以及再分化

實驗概要

了解培養(yǎng)基母液的配制方法和注意事項；掌握培養(yǎng)基的配制和滅菌方法，掌握植物組織培養(yǎng)的一般方法

實驗原理

（一）植物細胞的全能性  植物細胞的全能性即是每個植物的本細胞或性細胞都具有該植物的全套遺傳基因，因此在一定培養(yǎng)條件下每個細胞都可發(fā)育成一個與母體一樣的植株。這個概念雖然在本世紀初已經提出，但在當時的技術條件下，在實踐上并沒做到，經過幾十年來組織培養(yǎng)技術的不斷改進，目前細胞的全能性不但在理論上完全被證實，而且為組織培養(yǎng)在實踐上的應用奠定了基礎。 植物細胞要表現出全能性，須經過幾個步驟： 成熟細胞→分生細胞→胚狀體→完整植株。  成熟細胞→愈傷組織→出根出芽→完整植株。

  脫分化也就是已經分化定型的細胞，經過誘導成為重新恢復了分裂能力（也就是成為分生狀態(tài)）細胞的過程。 不但植物體細胞可以表現全能性，花粉在培養(yǎng)條件下也可能進行脫分化，通過愈傷組織或胚狀體發(fā)育成單倍體植株。 誘導細胞的脫分化，需要許多外界條件。任何一個分化的細胞都具有保持分生組織狀態(tài)的潛勢，不過它平常處于受抑制的狀態(tài)，消除抑制作用就可以使細胞恢復分裂。在各種外界條件中，外源激素對脫分化起重要作用。有些植物的外植體僅需加入生長素（IAA"吲哚乙酸"，NAA"萘乙酸"，2，4-D）即可誘導細胞的分裂與生長，如菊苣；有的僅需加入加細胞激動素類，如大豆、蘿卜；另一類需加生長素和細胞激動素類，如煙草髓、胡蘿卜、馬鈴薯；還有一類不需加任何激素，如冠癭組織，煙草腫瘤組織。

（二）組織的分化與器官建成  外植體誘導出愈傷組織后，經過繼代培養(yǎng)，可以在愈傷組織內部形成一類分生組織（meristemoid）即具有分生能較往年小細胞團，然后，再分化成不同的器官原基。有些情況下，外植體不經愈傷組織而直接誘導出芽、根。所以器官發(fā)生有兩種方式，即直接和間接的。  （1）外植體→器官發(fā)生（根、芽或胚狀體）→再生植株。 （2）外植體→愈傷組織→類分生組織→根、芽→再生植株。 根是組織培養(yǎng)中易形成的器官，形成芽的培養(yǎng)基條件常有不同，有時芽與根可以同時在組織培養(yǎng)中形成，一般說，培養(yǎng)物中形成的芽如胡蘿卜懸浮培養(yǎng)，油菜愈傷組織等。在組織培養(yǎng)中通過根、芽誘導再生植株方式有三種：一種在芽產生之后，于芽形成的基部長根而形成小植株，一種是在根上生長出芽來，另一種即在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后兩者結合起來形成一株植物。 

（三）培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基中各成分的比例及濃度與細胞或組織的生長或分化所需要的最佳條件相近似成功地使用該培養(yǎng)基進行組織培養(yǎng)的主要條件。營養(yǎng)培養(yǎng)基一般由無機營養(yǎng)、碳源和能源、維生素、植物激素（生長調節(jié)劑）和包括有機氮、酸和復雜物質的添加劑組成。

1、無機營養(yǎng)：礦質元素（礦物質）對植物的生命非常重要。例如：Ca是細胞壁的組成成分；氮是氨基酸、蛋白質、核酸和維生素的重要組成成分；鎂是葉綠素的組成成分；鐵、鋅和鉬是某些酶的組成成分。除了C、H、N、O外，還有12種其他元素是植物生長所必需的。植物對元素的需求濃度大于0.5mol/L時，這些元素稱為大量元素；而需求濃度小于0.5mol/L的元素則成為微量元素。和一般植物對元素的需求一樣，多種鹽能滿足組織培養(yǎng)對微量元素和大量元素的需求。N、K、P、Ca、S、Mg為大量元素。必需的微量元素有Fe、Mn、B、Cu、Zn、I、Mo、Co，植物對這些元素的需求量為微摩爾每升數量級。為了獲得最大的生長速度，每種營養(yǎng)成分的最佳濃度可以有相當大的變化。當礦物鹽溶解在水中時，他們被解離。培養(yǎng)基中的活化因子是不同種類的離子，而不是化合物。因此，通過對培養(yǎng)基中不同種類離子濃度的測定，就可以對兩種培養(yǎng)基做出比較。在大多數情況下，一種營養(yǎng)培養(yǎng)基所含的無機氮在25~60mmol/L之間。細胞能夠在硝酸鹽單獨存在的情況下生長，但是在更多的情況下，銨或者其他還原態(tài)氮對植物的生長又明顯的好處。另外，當培養(yǎng)基中僅含硝酸鹽時，pH會升高。當培養(yǎng)基中同時含有硝酸鹽和少量的銨化合物時，pH的這種變化就會被抑制。硝酸鹽和銨的應用范圍分別在25~40mmol/L和2~20mmol/L。對銨的響應得變化從抑制到必需依賴于組織類型和培養(yǎng)目的。在銨的量超過8mmol/L的情況下，或者組織生長在僅含這種氮素的培養(yǎng)基中時，培養(yǎng)液中也應該含有檸檬酸鹽、蘋果酸、琥珀酸或者其他TCA循環(huán)中的酸。大多數植物選擇硝酸鹽而不是銨，相反的情況也存在于另外一些植物中。鉀的需要濃度為2~26mmol/L，鉀一般以硝酸鹽或氯化物的形式提供，鈉不能代替鉀。濃度為1~3mmol/L的Ca、硫酸鹽、磷酸鹽和Mg通常能滿足要求。培養(yǎng)基中的Fe通常以螯合物的形式加入，當pH達到8時，這種形式的Fe仍可利用。

2、碳源和能源：沒有例外，標準碳源是蔗糖或葡萄糖。果糖也可以作為碳源，但是效果要差一些。培養(yǎng)基中的蔗糖可以迅速地轉化為葡萄糖和果糖。葡萄糖首先被利用，然后是果糖。培養(yǎng)基中的蔗糖濃度一般為2%~5%。其他的碳水化合物，包括乳糖、麥芽糖、半乳糖和淀粉也被使用做碳源，但是這下化合物的效果一般比蔗糖和葡萄糖差。大多數培養(yǎng)基含肌醇，其濃度約為100mg/L。肌醇可以改善細胞的生長。

3、維生素：正常植物（相對離體植物而言）可以合成其生長和發(fā)育所需要的維生素。但是，植物細胞的體外培養(yǎng)需要在培養(yǎng)基中加入維生素。維生素B1是植物生長和發(fā)育所必需的。煙酸和維生素B6可以改善細胞或離體植物的生長。一些培養(yǎng)基中含泛酸、生物素、葉酸、對氨基苯甲酸、氯化膽堿、核黃素和抗壞血酸。

4、生長調節(jié)劑：激素是高等植物合成的有機化合物，它們影響植物的生長和發(fā)育。植物激素的量很小，而且通常在產生它們的部位以外的地方作用。除了自然化合物，人們還合成了與自然激素相同的化合物。所有這些激素統稱為生長調節(jié)劑。主要的生長調節(jié)劑有兩類，它們在職務組織培養(yǎng)中具有特殊的重要性： ⑴生長素   生長素的共同特點是它們具有能導致細胞分裂和形成愈傷組織的性質。生長素引起細胞分裂、細胞生長和組織增大及不定根的形成。它經常抑制不定芽和腋芽的形成。當生長素的濃度較低時，不定根的形成占主導地位，然而，當生長素的濃度較高時，愈傷組織能夠形成，而根不能夠形成。最常用的高效化合物是2，4—二氯苯氧乙酸（2，4—T）。其他可以使用的生長素是萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4，5—三氯苯氧乙酸（2，4，5—T）、對氯苯氧乙酸（pCPA）和毒莠定。 ⑵細胞分裂素   細胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，它對誘導芽的產生具有重要作用。最常用的細胞分裂素有激動素、苯甲基嘌呤（BA）或6—芐氨基嘌呤（BAP）、玉米素和異戊烯基嘌呤（2iP）。這些化合物通常被用于刺激植物生長和發(fā)育。當把它們和生長素一起使用時，通?？梢源龠M細胞分裂，高濃度的（1~10mg/L）時可以誘導不定芽的形成，但是根的形成一般被抑制。它們通過降低頂端優(yōu)勢促進側芽的形成。 ⑶其他激素  赤霉素通常被用于植株的再生。一般情況下，赤霉素可以使節(jié)間生長、引起離體分生組織或芽的生長。赤霉素通常抑制不定根和不定芽的形成。 脫落酸是誘導胚形成的一個重要的生長調節(jié)劑。

5、有機添加劑：培養(yǎng)的正常細胞能夠合成其所需要的所有氨基酸，但是，當其中含有氨基酸（如谷氨酸）形式的有機氮和核苷酸存在時是有益的。外加氨基酸要慎重，因為這些氨基酸可能成為抑制劑。

6、膠凝劑：瓊脂是一種最常用的凝固劑，它在組織培養(yǎng)中作為支撐物。瓊脂的濃度過低，與水的親和力不強，難以形成有效的支撐；瓊脂的濃度過高，培養(yǎng)基就會變硬，妨礙營養(yǎng)向組織中擴散，離體生長將受到負面影響。 有支撐物的液體培養(yǎng)基可以取代固體培養(yǎng)基： ①不含瓊脂的液體培養(yǎng)基，以干凈的泡沫塑料、玻璃纖維為支撐物 ②懸掛在液體培養(yǎng)基中的過濾紙橋 ③生長在有玻璃珠的液體培養(yǎng)基中 ④位于濾紙下的纖維膠海綿代替瓊脂作為液體培養(yǎng)基的載體

7、pH：pH決定著生物大分子的結構和活性的許多方面。對于外植體的離體培養(yǎng)，合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.0~6.0。一般情況下，pH﹥7.0或pH﹤4.5時，生長和發(fā)育停止。培養(yǎng)基的pH在消毒前和消毒后不相同，一般情況下，經過高壓消毒后的培養(yǎng)基，其pH值回降低0.3~0.5。pH﹥6.0時，可以得到硬度合適的培養(yǎng)基，而pH﹤5.0時，瓊脂就不能形成令人滿意的凝膠。

主要試劑

詳見實驗步驟。

主要設備

鑷子、解剖刀、培養(yǎng)皿、 苗瓶、 酒精瓶、  超凈工作臺、三角瓶、電爐等；

實驗材料

種苗（ 從分生部上沿切取一段約25px左右的種苗莖，切好的外植體上應保留一片苗葉，若葉片上有萎黃部位，切除之），詳見實驗步驟。

實驗步驟

1、向燒杯中順序加入培養(yǎng)基母液： 大量元素 25ml    微量元素 2.5ml    鐵鹽 2.5ml    維生素、肌醇和甘氨酸各2.5ml    BA和NAA各2.0ml

  2、加入實際配制培養(yǎng)基體積約2/3－3/4的蒸餾水，加入10g蔗糖和3.5g瓊脂，將燒杯置于電爐上，攪拌加熱使瓊脂完全溶化，然后用蒸餾水準確稀釋至500ml，繼續(xù)加熱幾分鐘使之混合后分裝于10個100ml三角瓶中，以封口膜封口，用記號筆寫上學號和姓名。 分裝好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌條件為溫度121℃，壓力1.1kg/cm2,滅菌時間20min左右，滅菌后的培養(yǎng)基置于無菌室保存?zhèn)溆谩?br>
  3、將超凈工作臺用75%的酒精擦拭一遍，實驗中需要用到的器具（鑷子、解剖刀、培養(yǎng)皿）和裝培養(yǎng)基的三角瓶也用75%的酒精擦拭一遍后置于超凈工作臺中。打開紫外燈和風機，處理20-30分鐘。

  4、雙手用肥皂洗凈，再用75%酒精擦拭一遍后，連同用75%酒精擦拭過的種苗瓶一起進入超凈工作臺。進入超凈工作臺后，不得隨意出入，以免染菌。實驗過程中應盡量避免手直接接觸。

  5、點燃酒精燈，將鑷子和解剖刀在燈焰上烘烤后，插在酒精瓶中；在燈焰附近打開種苗瓶封口，從酒精瓶中取出鑷子和解剖刀，燈焰上烘烤后切取種苗于培養(yǎng)皿，使用過的鑷子和解剖刀放回酒精瓶（實驗中使用鑷子和解剖刀前均需在燈焰上烘烤滅菌，使用完后放回酒精瓶；在接種時，鑷子應盡量多烘烤一段，以防鑷子插入過深時，致使培養(yǎng)物染菌）；瓶口和封口膜內側燈焰上烘烤后封口；實驗過程中應盡量避免手直接接觸外植體材料。

  6、從分生部上沿切取一段約25px左右的種苗莖，切好的外植體上應保留一片苗葉，若葉片上有萎黃部位，切除之。

  7、在燈焰附近打開培養(yǎng)基瓶封口，接種過程中，培養(yǎng)基瓶口應一直對準燈焰，手不得接觸封口膜內側；將切好的外植體材料垂直插入培養(yǎng)基中，一瓶接種1-2個。此過程應盡快完成后封口。

  8、接種好的三角瓶24℃培養(yǎng)。2天后觀察，若有染菌需重做。一周后愈傷組織可形成。繼續(xù)分兩組培養(yǎng)：一組24℃光照培養(yǎng)，另一組24℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，觀察兩組培養(yǎng)物再分化情況。