動物細胞或組織的蛋白質(zhì)抽提步驟

一、培養(yǎng)的貼壁動物細胞的蛋白質(zhì)抽提步驟

1、從貼壁細胞培養(yǎng)瓶中小心傾去培養(yǎng)液。

2、預(yù)冷的PBS清洗貼壁的細胞2次，小心傾去PBS。

3、配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。

4、細胞瓶中加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（107個細胞中加入1ml抽提試劑；5×106個細胞中加入0.5ml抽提試劑），輕輕搖動5分鐘。

5、用一預(yù)冷的橡膠和塑料細胞刮將培養(yǎng)瓶壁上貼壁細胞刮下來，轉(zhuǎn)移細胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動15分鐘進行裂解。

6、裂解液于預(yù)冷的離心機中14，000xg離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。

二、培養(yǎng)的懸浮動物細胞的蛋白質(zhì)抽提步驟

1、2500xg離心10分鐘沉淀懸浮的細胞，棄去上清液

2、預(yù)冷的PBS懸浮沉淀細胞，2500xg離心10分鐘沉淀細胞，去上清。

3、配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。

4、加入含抑制劑的預(yù)冷蛋白質(zhì)抽提試劑（107個細胞中加入1ml抽提試劑；5×106個細胞中加入0.5ml抽提試劑）

5、輕輕搖動混和15分鐘進行裂解。

6、裂解液于預(yù)冷的離心機中14，000xg離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。

三、哺乳動物組織的蛋白質(zhì)抽提步驟

1、組織稱重，切小塊放入管中。

2、配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3、加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（250mg組織中加入1ml抽提試劑）。

4、用勻漿器每次30秒低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1分鐘，至組織完全裂解。

5、裂解液于預(yù)冷的離心機中14，000xg離心15分鐘。上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。