反向PCR （inverse-PCR）實(shí)驗(yàn)步驟

inverse-PCR是克隆插入片段側(cè)翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽性太多，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段。

基本步驟如下：

1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。

a. 選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物P1、P2；

b. 回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA片段環(huán)化；

c. 回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可擴(kuò)增到兩端為T-DNA插入序列，中間為側(cè)翼序列的片段。

2、限制性內(nèi)切酶消化：選擇合適的限制性內(nèi)切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應(yīng)對基因組DNA定量。

根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點(diǎn)EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點(diǎn)上游附近設(shè)計(jì)引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下：

37度 過夜，電泳檢測酶切效果。

3、回收DNA

① 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5ml離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250μl；

② 加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1min；

③ 最大速度（13, 000 rpm）離心1min；

④ 將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿，渦旋混勻，室溫靜置1min；

⑤ 最大速度（13, 000 rpm）離心2min；