PCR實驗的準備工作及步驟

    步驟構成：

    ①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備;

    ②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

    ③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在酶的作用下，以P為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

    重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

    實驗試劑與器材：

    模板DNA、2.5mmol/L q DNA聚合酶(5U/SSR引物

    10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

    PCR儀、移液槍、PCR板

    實驗步驟：

    一、實驗器具與材料：

    1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

    2、吸頭：1ml、200μl、20μl

    3、勻漿管：5ml

    4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個

    5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

    6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶(廣口，帶蓋)1個125ml的白色試劑瓶(放無水乙醇)

    7、量筒：50ml、250ml、500ml

    8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml

    9、試管架：5ml、1.5ml、20μl

    10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水

    11、鋁制飯盒：4個

    12、塑料小飯盒：1個

    13、大瓷缸：2個

    14、錫泊紙：一卷

    15、卷紙：2卷

    16、三角燒瓶：帶蓋，稍大

    實驗器具的處理與準備：

    1、塑料制品：(包括槍頭、EP管、勻漿管等)

    先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次(EP管)

    2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干)

    3、勻漿器：(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，再高壓(不需要泡DEPC)

    試劑配制：

    1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。

    2、75%乙醇：用無水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)

    3、異丙醇：放入棕色瓶中

    4：放入棕色瓶中

    5、瓊脂糖