實(shí)驗(yàn)室常用微生物菌種的分離和純化方法

一、目的要求

掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化物的基本操作技術(shù)。

二、基本原理

1.從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物的分離與純化。本實(shí)驗(yàn)采用平板分離法：該方法操作簡(jiǎn)便，普遍用于微生物的分離與純化，其包括兩個(gè)方面：

（1）選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其它微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物；

（2）微生物在固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落可以是一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等計(jì)數(shù)來(lái)完成的。

2.純培養(yǎng)的確定：

（1）確定其菌落觀察特征；

（2）結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征的確定。

三、器材

1.菌種：迷曲霉；

2.培養(yǎng)基：高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，牛rou膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基；

3.溶液或試劑：10%酚 盛9ml無(wú)菌水的試管 盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂；

4.儀器或者其他用具：無(wú)菌玻璃涂棒、無(wú)菌吸管、接種環(huán)、無(wú)菌培養(yǎng)皿、鏈霉素和土樣、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。

四、操作步驟

1. 稀釋涂布平板法

（1）倒平板：將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基， 高氏Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基；馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃， 高氏Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加入鏈霉素溶液。混勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿；

（2）制備土壤稀釋溶液：稱取土樣10g，放入盛有90ml無(wú)菌水并帶入玻璃珠的三角燒瓶，振動(dòng)約20min，使土樣與水分混合，將細(xì)胞分散.用一支1ml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取1ml加入另一個(gè)盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀釋的土壤溶液；

（3）涂布：將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板地面分別用記號(hào)筆寫上10-4，10-5，10-6三種稀釋度，然后用無(wú)菌吸管分別由10-4，10-5，10-6三管土壤稀釋液中各取0.1ml對(duì)號(hào)放入已寫好室溫下靜置5-10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基；

（4）培養(yǎng)：將高氏Ⅰ號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板;馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3-5天，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2-3天；

（5）挑菌落：將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)，大菌苔長(zhǎng)出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)將細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是為單一的微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

2.平板劃線分離法

（1）倒平板：按稀釋涂布平板倒平板，并用記號(hào)標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，土樣編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期；

（2）劃線：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述的土壤懸液一環(huán)在平板上劃線.劃線的方法很多，但無(wú)論采用那種方法，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落；

（3）挑菌落：同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認(rèn)為純化為止。