細胞凍存和復蘇實驗的血淚教訓和經(jīng)驗總結(jié),都是干貨喲!!!

    科幻電影中將凍存若干年的生命體重新解凍復活的情節(jié)在生命科學研究過程中每一天都在上演。為了將每一種有生命的細胞較好的保存其原有的細胞特性或者長久的保存種質(zhì)資源，實驗人員往往將細胞用特殊配置的細胞凍存液保存于-196℃ 的液氮，使得細胞暫時脫離生長狀態(tài)，等到實驗需要的時候再從液氮中取出復蘇應(yīng)用。在這一看似神奇的生命存儲過程中，我們不禁要問，這是如何實現(xiàn)的呢？

    其實，細胞凍存和復蘇的教科書和實驗手冊上面都有。小編不想再重復了。這里，我要談?wù)剳?yīng)該注意的一些事項和技巧，大部分都是血淚教訓和經(jīng)驗總結(jié)。都是干貨喲。

    1、冷凍越慢越好，復蘇越快越好
    高大上的實驗室可以使用程序冷凍儀。一切由機器代勞。屌絲實驗室就只好用人肉程序冷凍儀。具體的 protocol，到處都有。小編想提醒大家的是，細胞冷凍越慢越好，寧慢勿快。做細胞冷凍前，事先留出充足的時間。
    而復蘇速度越快越好。從液氮罐里取出來之后，迅速放在 37°C 水浴中，然后使勁搖呀搖。令其盡快融化。

    2、高高興興上班，平平安安回家
    細胞凍存和復蘇是細胞培養(yǎng)技術(shù)里面*容易出事的部分。凡是和液氮接觸的操作，注意戴保護眼鏡和手套。*需要小心的是：復蘇的時候，在水浴中搖呀搖的時候。有時候小瓶會爆炸的。所以，一定要戴保護眼鏡和手套。不多說了，說多了滿眼都是淚。還有，解凍之后，應(yīng)不應(yīng)該去除凍存液中的 DMSO 呢？答案是 Yes。為了保證細胞的正常生長，解凍后的細胞首先都要經(jīng)過離心，去除 DMSO 之后再加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng) 24 h 之后換液，以完全除去培養(yǎng)基中的 DMSO。當然了，如果你買遠慕的無毒凍存液，就不存在這個問題啦。

    3、凍存細胞數(shù)量要足夠
    無論再怎么小心，細胞在冷凍和復蘇過程中總會死掉一批的。所以，一開始凍存細胞的數(shù)量要足夠。一般要達到 5×106/毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個不能一概而論。有些細胞，比如雜交瘤細胞，只需要 1-3x106/毫升。

    4、做好標記
    把培養(yǎng)瓶放入提手，末端應(yīng)該扎有小牌，注明主人的名字，細胞名稱和凍存日期。還要在每個凍存管上寫上細胞名稱，代數(shù)和凍存日期。
    實驗室的液氮罐都是公用的。每個人應(yīng)該有屬于自己的提手。小編當年就發(fā)生過為了找自己的細胞，被迫把整個液氮罐翻了個底朝天的慘劇。

    5、細心呵護
    剛剛復蘇的細胞就象剛剛出生的 baby，非常脆弱。需要我們的細心呵護。培養(yǎng)液要事先在培養(yǎng)箱或者水浴中復溫。一切的和細胞接觸的動作都要輕柔。把細胞從凍存管里吸出來，注入離心管，要輕輕地吸取和滴加。包括給離心管補加培養(yǎng)液的時候，都要輕輕地滴加。離心要用低速離心（500-1000 轉(zhuǎn)/分鐘）。吹打要用專用的吹打管，而不要圖方便用移液槍，吹打也要輕輕的。

    6、DMSO 的問題
    那么，解凍之后，應(yīng)不應(yīng)該去除凍存液中的 DMSO 呢？答案是 no。除了極少數(shù)特別注明的對 DMSO 敏感的細胞外，99% 的細胞都不需要去除 DMSO。解凍后的頻繁換液會慢慢去除掉 DMSO 的。當然了，如果你買微科的無毒凍存液，就不存在這個問題啦。

    7、物離鄉(xiāng)貴，人離鄉(xiāng)賤
    解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)基和血清，培養(yǎng)基的選擇非常重要，目前國內(nèi)血清市場假貨泛濫，這里小編也推薦一下上海遠慕的，正品行貨有保證。因為每一種細胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)基和血清，會造成細胞生長不良，甚至死亡。這和一個人突然離家千里，會水土不服是一樣的道理。