一般 96 孔板我每孔是加 100 微升細胞懸液,從孔的左邊靠近底部加入。加完半邊板后,將未加的細胞懸液混一下,再繼續(xù)加剩余的半邊板子。都加完后蓋上蓋子,左手輕輕扶住板的左邊,右手輕輕敲擊板的右邊緣。
注意把握力度(我一般輕巧敲三下),太強或次數(shù)太多會導致細胞集中成堆,將板順時針旋轉(zhuǎn)(逆時針效果不好),依次敲擊剩余三個邊,靜置約 5 分鐘,放入 37 度培養(yǎng)箱。
6 孔板、12 孔板或 24 孔 板,我均采用將第一個孔加入少量無血清培養(yǎng)基,晃動浸潤整個孔底。然后用移液槍吸至第二孔,同樣方法浸潤孔底。其它孔一次類推,這樣整個孔底都是濕潤的,細胞懸液會平鋪在整個孔底。
加細胞懸液的時候可以避免加在中間中間細胞多,而加在周邊晃勻后周邊細胞多中間少的現(xiàn)象,細胞分散較均勻,注意加完細胞懸液后要放工作臺靜置一下。
這個方法就是有點慢,但操作熟練了也不慢。也可以采用輕拍的方式,但力度沒有 96 孔板好掌握,效果沒有 96 孔板好,所以我放棄改用浸潤孔底的方法。
細胞懸液加完后,將細胞培養(yǎng)板抬高,對著燈光,從底部往上看,看細胞有沒有抱團。然后從底部敲擊,使之分散。
如果實驗室有平板振蕩器的話,我建議用這個儀器稍振蕩一下,效果不錯,就是振幅小,頻率高的那種。
細胞要盡量打散,大部分呈單個狀態(tài)。離心后,要充分懸?。∵€有轉(zhuǎn)移到六孔板后,是要晃得?;蔚臅r候最好不要讓那個細胞液轉(zhuǎn)圈,不然細胞就全被帶到中間去了,就會不均勻。
一瓶細胞長滿后,正常處理,在培養(yǎng)瓶里吹勻。然后鋪 6 孔板,每孔 2 毫升,鋪完之后不用觀察直接用酒精棉擦拭。然后放到培養(yǎng)箱里,輕微的左三圈、右三圈、前三圈、后三圈?;旧?24 小時之后觀察 每孔的細胞都會很均勻。
計算好所需要的全部液體量和細胞量,混勻后,加到六孔板里,六孔板按橫 8 字型晃。顯微鏡下觀察,如果不均勻,按上述方法再晃。如果細胞未計數(shù)直接種的話,在種六孔板的過程中,隨時晃一下混勻用的瓶子,瓶子我通常是順時針或逆時針轉(zhuǎn)圈。
放在水平板面上先上下移動,再左右移動,每個方向5到6次,但關鍵的是搖完后最好直接放入培養(yǎng)箱中,不要再做過多的運動,例如放到鏡下去看,否則很容易就又聚到中間去了。