染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)你了解多少?

  染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化，以及DNA的鑒定。因?yàn)镃hIP實(shí)驗(yàn)涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)過程的每一步都應(yīng)設(shè)計(jì)相應(yīng)的對(duì)照，而且對(duì)結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗(yàn)。對(duì)于剛剛開始使用ChIP技術(shù)的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會(huì)達(dá)到事半功倍的效果，下面我們就最基本的實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)驗(yàn)中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。

1.細(xì)胞固定

 甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)是完全可逆的，便于在后續(xù)步驟中對(duì)DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。值得注意的是，交聯(lián)時(shí)間如果過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)材料也容易在離心過程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。

2.染色質(zhì)斷裂

 交聯(lián)后的染色質(zhì)可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段(用瓊脂糖凝膠電泳檢測)，以便暴露目標(biāo)蛋白，利于抗體識(shí)別。超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時(shí)間也不要太長，以免蛋白降解。Micrococcal Nuclease可以將染色質(zhì)切成一到幾個(gè)核小體，比超聲波處理的結(jié)果更精致，更均一(圖1)。另外，酶反應(yīng)的條件比較溫和，對(duì)DNA和DNA-蛋白復(fù)合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時(shí)，經(jīng)常采用的研究方法。因?yàn)镹-ChIP沒經(jīng)過甲醛固定，超聲波處理會(huì)打斷組蛋白和DNA的結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)的方法。對(duì)于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。