遇到酶切不動(dòng)或切不完全的處理辦法

遇到這種問(wèn)題常常需要了解酶活性單位是如何確定，我們多次接到這樣的問(wèn)題：1個(gè)單位的酶能在60分鐘內(nèi)切1ug的DNA,為什么我們的DNA那么少切那么長(zhǎng)時(shí)間也不能切開(kāi)或切完全？ 從下面幾個(gè)因素去考慮： 1) 酶是否有活性：酶的活性單位通常是在60分鐘酶切1ug lambda DNA或特定線狀DNA所需要的酶量。鑒定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是別的公司的酶來(lái)判定。因?yàn)椴煌久缚赡苁菑牟煌到y(tǒng)中純化的，雖然識(shí)別位點(diǎn)相同，但是酶的特性可能是有差異的。鑒定酶必須使用使用說(shuō)明書上認(rèn)定的酶活確定的方式，通常需要用lambda DAN做模板來(lái)判定。同時(shí)如果酶對(duì)甲基化敏感，還需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于運(yùn)輸或分裝不當(dāng)導(dǎo)致酶活性下降，這種情況是很少發(fā)生。遠(yuǎn)慕銷售的酶，在分裝前嚴(yán)格檢驗(yàn)過(guò)，不合格的東西（很少）都退回原廠，所以不合格的產(chǎn)品是不會(huì)送到用戶手頭的。

2) 模板性質(zhì)是否清楚：如果 DNA的類型變了所需要的酶量也不同。酶切效果與DNA的性質(zhì)（線狀，超螺旋狀）、位點(diǎn)數(shù)目、位點(diǎn)左右的序列、甲基化程度、純度等有很大的關(guān)系。對(duì)超螺旋狀DNA完全酶切所需要的酶量要比線狀的高好幾倍(在我們的目錄上有部分酶是有標(biāo)注的)，同時(shí)需要提高酶的用量（10U/ug）和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等措施。還有一個(gè)問(wèn)題是有些時(shí)候DNA是從別人那里得到的，背景不清楚也造成困惑。

3) 模板純度是否夠：模板制備方式影響DNA的質(zhì)量，制備過(guò)程中使用到乙醇，氯仿，苯酚，SDS, EDTA等如果殘留在最終的DNA模板中，都會(huì)不同程度影響酶的活性。Miniprep時(shí)如果用試劑盒抽提，需要的問(wèn)題污染是變性劑和乙醇；如果是手工制備的，氯仿，乙醇，苯酚及細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)都會(huì)不同程度的干擾酶活性。

4) 甲基化程度對(duì)酶的活性是否有影響：細(xì)菌中主要有Dcm和Dam兩種甲基化方式，在植物和動(dòng)物細(xì)胞中主要是CG位被甲基化。仔細(xì)看看使用的酶對(duì)甲基化的敏感情況，或許能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。

5) 反應(yīng)條件是否合適：對(duì)照說(shuō)明書，檢查使用的溫度是否正確，是否需要添加BSA, 是否使用正確的緩沖溶液。由于緩沖液中基本都含有DTT,反復(fù)凍融會(huì)使模板使DTT降解。注意有些研究人員將buffer長(zhǎng)時(shí)間放在4度或室溫，這是很不規(guī)范的行為。

6) 酶稀釋和添加方式是否正確：一般要求在最后加酶，但是對(duì)同時(shí)做多個(gè)相同反應(yīng)的時(shí)候，最后加酶有可能不很方便。通常是將緩沖、酶和適量的水配制成一個(gè)混合物，然后分裝，最后加模板。需要提醒的是混合物（Master Mix）中由于沒(méi)有底物的存在，離子強(qiáng)度也不對(duì)，酶可能要受到損傷。這種提前混合的做法沒(méi)有問(wèn)題，只是動(dòng)作要快一些，沒(méi)有分裝前的Mix，要求放在冰里，盡快使用。