瓊脂糖凝膠電泳實驗原理

實驗原理
瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定 DNA、RNA 分子混合物，以瓊脂凝膠作為支持物，利用 DNA 分子在電場中時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA 分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中由陰極向陽極運動。在一定的電場強度下，忽略DNA分子攜帶的電荷，DNA 分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA 分子的遷移速度與相對分子量成反比。


材料、試劑及器具
1、材料
合適的Marker（分子量標準）；DNA 樣品
2、試劑
加樣緩沖液（6x或10x）；瓊脂糖；溴化乙錠（EB）。
3、器具
（1）電泳系統(tǒng)：電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。
（2）凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀。


實驗過程
1、按所分離的 DNA 分子的大小范圍，選擇合適的比例的凝膠，稱取適量的瓊脂粉，放到一錐形瓶中，加入適量的 TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至瓊脂粉完全溶化，溶液透明。稍搖勻，得膠液。待膠液卻至 60℃左右，在膠液內加入適量的比例的溴化乙錠液。
2、水平放置膠槽，在一端插好梳子，在槽內緩慢倒入已況至 60℃左右的膠液，使之形成均勻水平的膠面。
3、待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。
4、在槽內加入TBE電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面。
5、把待檢樣品，按合適比例與加樣緩沖液混勻，用移液槍加至凝膠的加樣孔中。
6、接通電泳儀和電泳槽，并接通電源，調節(jié)合適電壓，穩(wěn)壓輸出，開始電泳。
7、觀察溴酚蘭的帶（藍色）的位置。當其移動至約凝膠長2/3處時，可停止電泳。
8、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜，趕去氣泡平鋪，然后把凝膠放在上面。關上樣品室外門，打開紫外燈（360nm 或 254nm），通過觀察孔進行觀察。


注意事項
1、電泳中使用的溴化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物質，務必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門電泳區(qū)域操作，戴一次性手套，并及時更換。
2、預先加入EB 時可能使 DNA 的運動速度下降15%左右，且不同構型的 DNA 的影響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束后再用 0.5μg/ml 的 EB 溶液浸泡染色。EB在光照下易降解，若凝膠放置一段時間后才觀察，即使原來膠內或樣品已加 EB，建議選擇EB溶液浸泡染色。
3、加樣進膠時不要形成氣泡，需在凝膠液未凝固之前及時清除，否則，需重新制膠。
4、電泳時溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的運動速度可以用于參考電泳速度，已實際電泳條帶運動速度為準。