Hoechst33258/PI細(xì)胞凋亡染色試劑盒操作步驟

中文名稱：Hoechst33258/PI細(xì)胞凋亡染色試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：100T
分類：細(xì)胞染色
用途：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死
注意事項(xiàng)：Hoechst33258是一種熒光染料,可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,對(duì)細(xì)胞的毒性較低。Propidium Iodide簡(jiǎn)稱PI,又稱碘化丙啶,對(duì)人體有刺激性。Hoechst33258能被活細(xì)胞攝取,與DNA結(jié)合,在紫外線下呈藍(lán)色熒光。PI使死細(xì)胞著色產(chǎn)生紅色熒光。在散點(diǎn)圖上結(jié)果為：正常細(xì)胞呈低藍(lán)/紅光,凋亡細(xì)胞呈高藍(lán)/低紅光,壞死細(xì)胞呈低藍(lán)/高紅光。
儲(chǔ)存條件：—20℃,避光,12個(gè)月

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Hoechst33258/PI細(xì)胞凋亡染色試劑盒(Hoechst 33258/PI Apoptotis Assay Kit)是一種采用Hoechst 33258和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙熒光染色方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞壞死分析的檢測(cè)試劑盒。單純的PI染色能夠觀察DNA直方圖上凋亡細(xì)胞的亞G1峰，但只能代表G0/G1期發(fā)生凋亡，無(wú)法觀察S期和G2期發(fā)生的細(xì)胞凋亡，而且細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定后無(wú)法對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。Hoechst 33258可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞與DNA結(jié)合，能在紫外線下顯示藍(lán)色熒光，而且染色后凋亡細(xì)胞熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。PI不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能染色。而對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，PI可以穿透細(xì)胞膜使壞死細(xì)胞著色產(chǎn)生紅色熒光。

Hoechst 33258/PI雙染后，可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。在二元直方圖上，正常細(xì)胞對(duì)Hoechst33258具有拒染性，呈弱藍(lán)色熒光＋弱紅色熒光(Hoechst 33258+/PI+)；凋亡細(xì)胞對(duì)Hoechst33258具有嗜染性，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光+弱紅色熒光(Hoechst 33258 /PI+)；壞死細(xì)胞對(duì)PI具有嗜染性，呈弱藍(lán)色熒光＋強(qiáng)紅色熒光。本試劑盒亦可用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，檢測(cè)細(xì)胞含量范圍一般為0.1～1×106之間。


自備材料：
胰蛋白酶消化液
流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡
PBS
細(xì)胞計(jì)數(shù)板


操作步驟(僅供參考)：
1、細(xì)胞樣品的制備：
⑴貼壁細(xì)胞：
①小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)備用。
②用胰蛋白酶消化細(xì)胞至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。
③收集上述細(xì)胞懸液到離心管內(nèi)，4℃ 1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。
④加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)菌離心管，4℃ 1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。
⑤小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

⑵懸浮細(xì)胞：
①4℃ 1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底，小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl培養(yǎng)液，以免吸走細(xì)胞。
②加入約1ml提前預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5ml無(wú)菌離心管，4℃ 1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底。
③小心吸取上清并丟棄，可留大約50μl PBS，以免吸走細(xì)胞，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。

2、配制Cell Stain Buffer工作液：取適量Cell Stain Buffer(2×)與無(wú)菌去離子水或蒸餾水等比例混合，即為Cell Stain Buffer工作液，4℃保存?zhèn)溆谩?br>
3、重懸細(xì)胞：取上述收集好的0.1～1×106細(xì)胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細(xì)胞沉淀。

4、Hoechst 33258/PI染色：
⑴一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，輕輕混勻， 置于冰浴或4℃，孵育20～30min。
⑵兩步法：
①加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15min
②置于冰水中冷卻后，4℃ 1000g離心3～5min，使細(xì)胞沉到管底，棄上層染色液。
③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重懸細(xì)胞沉淀。
④加入5μl PI Stain， 置于冰浴或4℃，孵育20～30min。


5、檢測(cè)與分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)400～500nm檢測(cè)藍(lán)色熒光，在大于630nm處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用熒光顯微鏡檢測(cè)，檢測(cè)前4℃ 1000g離心3～5min沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色熒光和藍(lán)色熒光。對(duì)于貼壁細(xì)胞使用熒光顯微鏡檢測(cè)，亦可不收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后直接依次按照上述比例加入試劑(A)、試劑(B)、試劑(C)，冰浴或4℃染色20～30min。染色后PBS洗滌一次，再在熒光顯微鏡下觀察。

染色結(jié)果：在藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，正常細(xì)胞呈低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞呈高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞呈低藍(lán)光/高紅光。

注意事項(xiàng)：
熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測(cè)。
在為了獲得細(xì)胞沉淀的離心的過(guò)程中，對(duì)于特殊細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)提高離心力或延長(zhǎng)離心時(shí)間。
Heochst 33258與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20min以內(nèi)。太長(zhǎng)容易引起Heochst 33258的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變。
如果用于組織的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)，則必須把組織消化后，制備成單細(xì)胞懸液，才可以進(jìn)行檢測(cè)
PI對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。