Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑操作方法

中文名稱：Lipofect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑
用途：適合于將核酸(DNA和RNA)轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞。
注意事項：無菌溶液，是一種新型的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，具有低細(xì)胞毒性；對多種類型的細(xì)胞和培養(yǎng)板都具有高轉(zhuǎn)染效率。
儲存條件：4℃，12個月
產(chǎn)品規(guī)格：0.5mL|1mL|5×1mL

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法主要包括：電穿孔法、顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染等，理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法是具有高轉(zhuǎn)染效率、對細(xì)胞的毒性作用小等，脂質(zhì)體(lipofectin+regeant，LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium+Chloride(DOTMA)和Dioleoyl+photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進行轉(zhuǎn)染時，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：第1，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時間，DNA可從1~5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時間(2~24小時)。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24小時為宜。細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

一、脂質(zhì)體(liposome)轉(zhuǎn)染方法原理脂質(zhì)體(liposome)轉(zhuǎn)染方法原理：脂質(zhì)體((Iiposome)作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具，已經(jīng)研究的十分廣泛，用合成的陽離子脂類包裹DNA，同樣可以通過融合而進人細(xì)胞。使用脂質(zhì)體將DNA帶人不同類型的真核細(xì)胞，與其它方法相比，有較高的效率和較好的重復(fù)性。中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體，DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。

二、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟
1、操作步驟[方法一]：
(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105個細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃CO2培養(yǎng)至40%~60%匯合時(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。
(2)+轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10μg+DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50μgLR，終量100μL，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。
(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。+(4)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。+(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。+注意：轉(zhuǎn)染時切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下[方法二]：
(1)以5×105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時，使其達(dá)到50~60%板底面積。
(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：+①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。+②旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。+③室溫下放置5~10分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。
(3)棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL+DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3~5小時。
(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14~24小時，
(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)24~48小時。
(6)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：
(1)接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。
(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2)、(3)步驟。
(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養(yǎng)48小時。
(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進行。