什么是反向PCR（inverse PCR）

反向PCR（inverse PCR）

反向PCR是一種多 聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）應(yīng)用的方法，可使已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR擴(kuò)增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向可使鏈的延長(zhǎng)經(jīng)過(guò)環(huán)上的未知區(qū)而不是分開(kāi)引物的核心區(qū)。這種反向PCR方法可用于擴(kuò)增本來(lái)就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應(yīng)用于制備未知序列探針或測(cè)定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。
用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴(kuò)增的片段的大小由 PCR擴(kuò)增片段的大小決定，目前，PCR擴(kuò)增的實(shí)際上限為3-4 kb。在許多情況下，首先需要進(jìn)行Southern雜交來(lái)確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴(kuò)增引物所定模板（依賴于引物）的上游或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴(kuò)增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類(lèi)型決定的接點(diǎn)（例如，互補(bǔ)突頭連接與鈍頭連接）。對(duì)于擴(kuò)增左翼或右翼序列，初試時(shí)最好靠近識(shí)別多個(gè)堿基位點(diǎn)的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點(diǎn)。如果用反向PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測(cè)雜交探針，建議事先在載體中引入合適的酶切位點(diǎn)。

用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中，為產(chǎn)生對(duì)反向PCR大小適當(dāng)?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán)化前需用Klenow或噬菌體T4 DNA 聚合酶 修理（鈍化）。連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切酶失活。

聚合酶鏈反應(yīng)條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火，Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測(cè)序時(shí)，與核心區(qū)末端后部結(jié)合的擴(kuò)增引物更為有用，它使測(cè)序引物擴(kuò)增部分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點(diǎn)更近，減少了擴(kuò)增引物的干擾