線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)使用說明書

中文名稱：線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)

產品規(guī)格：50T/100T

用途：細胞凋亡的生物化學分析，線粒體膜電位檢測

注意事項：要由JC-1染料儲存液，JC-1 buffer、CCCP等組成，可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位，采用FACS檢測。

儲存條件：-20℃，避光，12個月

檢測原理：

線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）是一種以JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于檢測線粒體的健康狀態(tài)，也是用來檢測細胞早期凋亡的常用方法。

是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針。JC-1染料表現(xiàn)出電勢依賴性的積聚在線粒體內。正常線粒體內，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發(fā)出強烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中，產生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。因此顏色的變化非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。線粒體的去極化程度也可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。

線粒體膜電勢的破壞是細胞凋亡早期發(fā)生的一個標志性事件。細胞受到凋亡誘導后線粒體膜電位的變化使得膜的通透性發(fā)生改變。膜通透性的增加，使得線粒體蛋白包括細胞色素C、Smac/DIABLO、HtrA2/OMI、核酸內切酶G（EndoG）、凋亡誘導因子（AIF）等從線粒體基質釋放到細胞漿。細胞色素C的釋放伴隨膜電位的完全喪失，進而引發(fā)細胞凋亡酶的級聯(lián)效應。

JC-1染料的優(yōu)勢：

染料用途廣：可用來檢測各種細胞類型包括單核細胞和神經(jīng)細胞，以及完整組織和純化的線粒體；

染料特異性更高：與其他的陽離子染料如DiOC6(3)和羅丹明123相比，對線粒體膜電位變化的特異性高于質膜電位變化，對線粒體去極化檢測的檢測一致性更好；

紅綠色熒光強度比率只受線粒體膜電位的變化，不受線粒體大小，形狀，密度的差異干擾；

檢測靈敏度強，對細胞應激反應的微小異質性都能辨別；

操作步驟（詳細步驟請見說明書）：

1. JC-1 染色工作液的配制

取適量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL 超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mL JC-1 染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1 染色工作液。

2. 陽性對照的設置

CCCP（10mM）推薦按照1∶1000 的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細胞20分鐘。對于大多數(shù)細胞，通常10μM CCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-1染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng)JC-1染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。

3. 線粒體膜電位檢測（懸浮細胞）

（1） 取1.0～6.0×105 細胞，重懸于0.5mL 細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

（2） 加入0.5mL JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。

（3） 孵育期間按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

（4） 37℃孵育結束后，600g 4℃離心3～4 分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

（5） 用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2 次：加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g 4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。再加入1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g 4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。

（6） 再用適量JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4. 線粒體膜電位檢測（貼壁細胞）

5. 線粒體膜電位檢測（純化的線粒體）

6. 熒光觀測和結果分析

注意：

CCCP陽性對照屬于線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒性。操作時需避免直接接觸皮膚；

為了個人的安全和健康，請戴手套，口罩還有實驗服進行操作；