維生素B2 (核黃素) 熒光測(cè)定法實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法原理：核黃素能形成一種具有黃綠色熒光的黃色溶液。它在稀溶液中，440～500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定的熒光強(qiáng)度與核黃素的濃度成正比。根據(jù)其在還原后的熒光差數(shù)，可測(cè)定核黃素的含量。

實(shí)驗(yàn)材料：

核黃素

試劑、試劑盒

高錳酸鉀溶液 熒光紅鈉 硫代硫酸鈉 冰醋酸

儀器、耗材

熒光分光光度計(jì) 玻璃器
溶液配制：

1. 3 %高錳酸鉀溶液：將高錳酸鉀3 g溶于水，稀釋至100 ml，每星期配制一次。

2. 核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 μg/ml）：取儲(chǔ)備液（25 μg/ml）1 ml，稀釋至50 ml，臨用前配制。

3. 熒光紅鈉儲(chǔ)備溶液（50 μg /ml）：50 mg熒光紅鈉溶于1000 ml水中。

4. 熒光紅鈉應(yīng)用液（0.05 μg/ml）儲(chǔ)備液稀釋至1000 ml。

操作步驟：

1. 樣品提取

（1）稱取含有核黃素5～10 μg的均勻樣品于125 ml錐形瓶中，加入50 ml 0.1 mol/L鹽酸，置于高壓下蒸煮30 min。

（2）將樣品冷卻，用氫氧化鈉調(diào)至pH 6.0（因核黃素在堿性溶液中不穩(wěn)定，滴加堿液時(shí)邊加邊搖，避免局部堿性過強(qiáng)），再迅速用1 mol/L鹽酸調(diào)至pH 4.5，使雜質(zhì)沉淀。

（3）用水稀釋至100 ml，過濾。如樣品量過大，可過濾后稀釋，樣品稀釋度由所用標(biāo)準(zhǔn)液濃度來定。

2. 濾液酸化

（1）取兩個(gè)試管（A），分別加入10 ml濾液和1 ml水。

（2）另取兩個(gè)試管（B），分別加入10 ml濾液和1 ml核黃素標(biāo)準(zhǔn)液（0.5 μg/ml）。

（3）以上四個(gè)管各加1 ml冰醋酸。

3. 純化

（1）每個(gè)試管各加入0.5 ml 3%高錳酸鉀，混勻后放置2 min以充分氧化樣品內(nèi)的雜質(zhì)。

（2）另取兩個(gè)試管（C），分別加入10 ml濾液和1 ml水及1 ml冰醋酸，然后向兩支試管中各加入20 mg硫代硫酸鈉，使樣品中的雜質(zhì)與核黃素都還原成無熒光物質(zhì)，再搖動(dòng)，使核黃素與空氣接觸而被氧化，測(cè)其熒光。

（3）在A、B管內(nèi)各加0.5 ml 3%雙氧水（其不宜過量，以免產(chǎn)生氣泡，影響熒光讀數(shù)），混勻，10 s內(nèi)褪去顏色。

4. 熒光測(cè)定

（1）用熒光紅鈉溶液調(diào)整指針，使之每次都在一定的讀數(shù)上（如50～80）。

（2）濾液加水的熒光讀數(shù)為A。

（3）濾液加標(biāo)準(zhǔn)液的熒光讀數(shù)為B。

（4）濾液內(nèi)加硫代硫酸鈉的熒光讀數(shù)為C。