構建穩(wěn)定表達細胞株

構建穩(wěn)定表達細胞株的基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含抗性基因進行篩選，可得到穩(wěn)定表達目的蛋白、或者穩(wěn)定表達沉默特定基因的細胞株，即穩(wěn)轉株。

構建穩(wěn)轉株主要有兩種方法：線性質粒瞬時轉染法和慢病毒感染法。質粒轉染受制于質粒大小、轉染介質的限制，對很多細胞轉染效率低，而且質粒整合入細胞基因組的效率極低，所以構建穩(wěn)轉株的成功率不高。而慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞，并且在感染后容易整合到受感染細胞的基因組，進行長時間穩(wěn)定表達，因此，慢病毒是目前用于構建穩(wěn)轉細胞株最主流的方法。
構建流程以及注意事項

1. 慢病毒載體構建，過表達載體或者干擾載體構建

慢病毒過表達載體有基因容量限制，對于大于5k的基因，包裝出慢病毒的概率很低，不建議包裝病毒。同時大于3k的目的基因也可能有不出毒或者出毒量低，在做正式實驗之前，可用先進行病毒的小量包裝，成功后再進行病毒大量包裝。對于敲低，通常的策略是對一個基因同時選擇3個干擾靶點，通過qPCR驗證干擾效率之后，使用效率好的靶點進行下一步實驗。

慢病毒載體帶有不同的標簽，如果研究細胞定位，可以選擇帶熒光標簽的慢病毒載體，比如帶GFP/RFP等；如果準備篩選穩(wěn)轉細胞株，可以選擇帶篩選標簽的慢病毒載體，比如puro/neo等載體；如果目的基因大小適中，也可以選擇同時帶熒光標簽和篩選標簽的載體。

2. 293T細胞培養(yǎng)及慢病毒包裝

細胞的狀態(tài)對于病毒包裝有很大的影響，如果細胞狀態(tài)不好可能不出毒或者出毒量很低。取狀態(tài)良好，處于對數生長期的293T細胞進行慢病毒包裝。第三代四質粒包裝質粒配比，可以按照分子量來折算，并在附近量做實驗，摸索最適質粒配比，以得到更高滴度的病毒。

3. 慢病毒滴度檢測及保存，使用熒光梯度稀釋法或者qPCR法檢測

慢病毒表達時間較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染后72小時后觀測熒光表達或者qPCR檢測。感染期間請根據細胞生長的情況對細胞進行及時換液，以保證細胞良好的生長狀態(tài)。值得考慮的是使用低濃度的血清來培養(yǎng)細胞，作用是抑制細胞增殖。

特別注意，慢病毒可以存放于-80℃6個月以上，但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前重新滴定病毒滴度。反復凍融會降低病毒滴度，每次凍融會降低病毒滴度10%，因此，在病毒使用過程中應盡量避免反復凍融，強烈建議收到病毒后按照每次的使用量將病毒進行分裝。

4. 目的細胞MOI值摸索，確定最適慢病毒感染復數

同一種細胞在不同實驗室中由于傳代次數、操作細節(jié)的不同，細胞狀態(tài)會有所差異，另一方面病毒液在運輸、保存過程中可能造成即時滴度的變化。因此為了達到最佳的實驗效果，建議在正式實驗前進行3-4種不同MOI的感染預實驗。細胞匯合度對抗生素篩選結果的影響很大，一般篩選時細胞匯合度不宜超過50%。

5. 目的細胞藥物篩選濃度確定-通過梯度實驗

使用不同濃度的抗生素對細胞進行處理，選擇出在10-14天內使細胞全部死亡的最低抗生素濃度來進行下一步的篩選試驗。不同的細胞對于同一種抗生素，其篩選濃度不同，而同一種細胞對于不同的抗生素，其最佳使用濃度也不同。所以在進行穩(wěn)轉株篩選之前，一定要先進行藥物濃度篩選預實驗以確定最佳藥物篩選濃度。

6. 慢病毒感染目的細胞篩選穩(wěn)轉株

由于基因轉染到細胞內之后要一段時間才能表達出蛋白質，所以篩選不能太早，但是也不能太晚，因為轉染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆。一般在轉染24小時之后才開始加抗生素記性篩選。加藥篩選后，死亡的細胞會裂解釋放出有害物質，導致那些有抗生素表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液。

7. 穩(wěn)轉株檢測

通過qPCR或者Western Blot檢測目的基因，需要注意的是，mRNA的表達水平可能和蛋白的表達水平不一致，如果需要進一步研究蛋白的功能，可以使用WB檢測蛋白的表達水平。

一般需要構建穩(wěn)定株的情況如下：

1. 長期在目的細胞中研究基因功能，通過構建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉染或者病毒包裝的成本，也極大方便實驗研究；

2. 部分蛋白半衰期極長，瞬時 RNA 只能干擾表達，無法去除已經表達的目的蛋白，通過構建穩(wěn)定株可以實現更好的基因干擾效果；

3. 瞬轉往往會引入極高拷貝數的表達，導致因為人為因素造成實驗結果的不精確，構建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數適量的細胞進行實驗研究；

4. 需要用誘導表達系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時空表達的；

5. 需要用細胞做動物實驗的，比如裸鼠成瘤等，往往需要構建成穩(wěn)轉株。