細胞瞬時轉染原理及實驗步驟

哺乳動物細胞瞬時轉染能在短期內快速表達高活性蛋白而被廣泛應用。本文主要介紹了細胞瞬時轉染的步驟、原理，及血球計數(shù)板對細胞計數(shù)的原理和方法。

哺乳動物細胞自身具有蛋白折疊和翻譯后修飾的功能，獲得的蛋白更具有天然活性。哺乳動物細胞生產蛋白的方式有兩種：瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。瞬時轉染的特點是短期快速表達，滿足蛋白的小量制備。而穩(wěn)定轉染通過構建穩(wěn)定細胞系能夠滿足蛋白的大量、長期生產。

瞬時轉染是指將構建好的質粒通過某種方式導入到哺乳動物細胞內（主要指 HEK293 細胞），該質粒上的外源基因不整合到細胞自身的基因組上。隨著細胞的生長分裂，外源基因會逐漸丟失。質粒在細胞內能夠存在 3-4 天，此時間內，質粒外源基因在細胞內發(fā)生轉錄翻譯，得到極為少量的蛋白。這一整個快速轉染得到蛋白的過程就稱為瞬時轉染表達。

細胞復蘇

細胞復蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細胞復蘇的關鍵是快速。防止在解凍過程中，產生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復蘇一般步驟如下：

1. 預先加熱水浴鍋，溫度至 37-40℃，并在離心管中準備好 10mL 培養(yǎng)基

2. 從液氮罐或冰箱中取出細胞，迅速放進預熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻

3. 當凍存管內完全融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有 10mL 培養(yǎng)基的離心管中

4. 離心 5min，去除上清，得到沉淀

5. 用培養(yǎng)基懸浮沉淀，并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)細胞培養(yǎng)

細胞復蘇后，生長一段時間，95%的細胞貼壁生長，細胞狀態(tài)良好，說明細胞復蘇成功。

瞬轉步驟

以 Lipofectamine 轉染試劑為例的操作流程，不同轉染試劑參考說明書

1. 將復蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細胞按照 1-3x105 接種到 6 孔板中，加入 2-4mL 的完全培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃過夜

2. 無菌狀態(tài)下配置如下溶液：

a 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 2ug 的待轉染的質粒

b 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 25ul 的 Lipofectamine 轉染試劑（血清的存在會影響細胞轉染效率，因此要使用無血清培養(yǎng)基轉染）

3. 將 ab 溶液混合并搖勻，室溫下放置 30min 左右

4. 細胞培養(yǎng)至 80%單層左右，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞 2 次，每孔加入 1mL 的無血清培養(yǎng)基，并將混合后的 ab 溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 24 小時

5. 將轉染液倒出，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng) 3-4 天后檢測蛋白表達量

轉染檢測

收集培養(yǎng)的細胞，采用超聲或酶解的方法破碎細胞，離心得到上清。轉染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進行驗證，或可使用先達基因ERA法進行檢測，簡單，快速，準確。蛋白水平，使用 western blot 檢測。

細胞計數(shù)

細胞計數(shù)的原理就是測定單位體積內細胞的數(shù)量從而得到細胞總濃度，在細胞培養(yǎng)和測定細胞生長曲線的過程中廣泛應用。本實驗是采用血球計數(shù)板對細胞計數(shù)，步驟如下：

1. 將計數(shù)板的蓋玻片洗凈晾干，并消化細胞離心加入培養(yǎng)基懸浮細胞，制得細胞懸液

2. 稀釋細胞懸液，按照一定的倍數(shù)

3. 蓋玻片蓋上計數(shù)板表面，移液器吸取 10ul 左右的細胞懸液從血球計數(shù)板的一方慢慢注入到計數(shù)板上

4. 蓋玻片具有引流的功能，因此只需輕輕打入到板上孔中即可

5. 顯微鏡下觀察細胞，按照要求計數(shù)該血球計數(shù)板上的細胞個數(shù)，計數(shù)方式如圖所示



圖 3 血球計數(shù)室表面



每個血球計數(shù)板有上下兩個計數(shù)室（如圖 1）

每個計數(shù)室分為九大格（如圖 3）

其中最中間的方格分為 25 個中格，每個中格又被分為 16 個小格，因此計數(shù)室中一共有 400 個小格。每次計數(shù)時選取圖 3 中紅色部分計數(shù)，計數(shù)結果乘以 5 得到一個計數(shù)室中總的細胞個數(shù)