遠慕實驗：原代細胞培養(yǎng)實驗步驟

原代細胞的培養(yǎng)步驟

一、靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求

1、細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性；

2、細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L；

3、培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DNEM培養(yǎng)；

4、小牛血清濃度為10%-80%；

5、應在37℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

6、在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落，漂浮；

7、待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網狀，應將原代細胞換液；

8、用骨髓或外周血中的懸浮細胞經靜置培養(yǎng)1周時，應將細胞懸液經低速離心后換液。

二、懸浮細胞的培養(yǎng)要求

1、原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細胞；

2、短期培養(yǎng)，可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進行；

3、細胞濃度可在5-8×109/L范圍內進行分瓶試驗；

4、長期培養(yǎng)時，淋巴細胞中要加入生長因子，白血病細胞中要加入少量的原患者血清，以利細胞生長；

5、細胞換液一般每隔3天需半量換液一次；

6、細胞傳代一般待細胞增殖加快、細胞密度較高時才能進行。

三、原代細胞的維持

1、貼壁細胞長成網狀或基本單層時，未達到飽和密度，需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細胞繼續(xù)生長繁殖的需要；

2、換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液；

3、懸浮細胞細胞培養(yǎng)基中不僅會發(fā)生轉化而且會發(fā)生分裂繁殖，此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細胞的營養(yǎng)需求，需進行換液。通常采用半量換液的方法；

四、原代細胞培養(yǎng)的首次傳代

原代培養(yǎng)后由于懸浮細胞增殖，數量增加甚至達飽和密度；貼壁細胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續(xù)生長繁殖，需要進行分瓶培養(yǎng)，這種使原代細胞經分散接種的過程稱之為傳代。

首次傳代應注意以下幾點：

(1)細胞生長密度不高時，不能急于傳代。

(2)原代培養(yǎng)的貼壁細胞需控制消化時間。

(3)吹打已消化的細胞應減少機械損傷。

(4)首次傳代時細胞接種數量要多一些。

(5)首次傳代培養(yǎng)的pH應偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。

五、其他培養(yǎng)法

（一）組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團塊接種于培養(yǎng)瓶（或皿）中，瓶壁可預先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁，使周邊細胞能沿瓶壁向外生長。

（二）懸浮細胞培養(yǎng)法

對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。

（三）器官培養(yǎng)

器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細間的聯系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節(jié)作用。