如何閱讀基因載體圖譜

基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強有力的生物工具，我們先來認(rèn)識和閱讀載體圖譜吧。

 

一、載體分類及載體組成元件

 

載體分類

 

1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體

病毒載體是一種常見的分子生物學(xué)工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進入目的細胞，進行感染的分子機制。可發(fā)生于完整活體或是細胞培養(yǎng)中。可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗。用于基因治療和疫苗的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：

（1）攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；

（2）介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達；

（3）對人體不致?。?/p>

（4）在環(huán)境中不會引起增殖和傳播。

   非病毒載體一般是指質(zhì)粒DNA。

2、按進入受體細胞的類型分類：原核載體、真核載體、穿梭載體（含原核和真核2個復(fù)制子，能在原核和真核細胞中復(fù)制，并可以在真核細胞中有效表達）。

3、按功能分類：克隆載體、表達載體

克隆載體：具有克隆載體的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以攜帶DNA片段或外源基因進入受體細胞并克隆和大量擴增DNA片段（外源基因）的載體。

   表達載體：克隆載體中加入一些與表達調(diào)控（具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序）有關(guān)的元件即成為表達載體。

 

載體組成元件

 

1、復(fù)制起始位點Ori：即控制復(fù)制起始的位點。Ori的箭頭指復(fù)制方向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向（正向）。

2、抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ，Kan+

（1）Ampr：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）tetr ：可以阻止四環(huán)素進入細胞。

（3）camr：生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。

（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。

（5）hygr：使潮霉素β失活。

3、多克隆位點：MCS克隆攜帶外源基因片段，它具有多個限制酶的單一切點，便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。還要再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

4、P/E：啟動子/增強子

5、Terms：終止信號

6、加poly（A）信號：可以起到穩(wěn)定mRNA作用

 

示例閱讀載體：

pENTER載體

 

1）human ORF + pENTER載體 

2） CMV啟動子，T7啟動子 

3） ORF的C端融合了Flag和His tag

4)  多克隆位點，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常見的) 

4） SV40 poly（A）加尾信號

5） SV40啟動子啟動的puro標(biāo)記 

6） 2個腺病毒ITR序列和2個與腺病毒Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組到腺病毒載體，直接用于腺病毒的生產(chǎn)。

 

慢病毒載體

 

1）EF1a啟動目的基因（可添加小標(biāo)簽FLAG或HIS等小標(biāo)簽） 

2）CMV啟動GFP，非融合抗性篩選標(biāo)記Puro（便于做細胞株的穩(wěn)篩）

3）WPRE（來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件），放置在目的基因的上游，能加強轉(zhuǎn)基因的表達

4)  cPPT（來自HIV-1整合酶基因），增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度

5）第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1基因組中的順式調(diào)節(jié)元件(ψ 包裝 信號和LTR 長末端重復(fù)序列，其中3’LTR增強子功能缺失，5’LTR中U3區(qū)替代為CMV，更加安全的病毒載體)

 

腺相關(guān)病毒載體

 

AAV表達載體包括了中兩個ITR + CMV（可替換其他組織特異性啟動子，見改造載體部分）+ globin intron 內(nèi)含子序列 + 目的基因 + poly A序列

 

二、選擇和準(zhǔn)備載體

 

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時還要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點等。如果構(gòu)建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。選用哪種載體，還是要結(jié)合目的基因及載體特點以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

 

載體選擇主要考慮下述3點：

 

1、構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

2、載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力—據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。尤其對于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評估能否成功包裝病毒的首要因素。

①腺病毒可以插入長約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。

②慢病毒的包裝容量約為6kb（包含載體帶有的其他抗性基因或報告基因），但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會下降1個單位數(shù)量級的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進行評估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作為受體、轉(zhuǎn)運蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包裝可能會有一定難度。

③AAV的總包裝容量是4.7 kb（包含載體中兩個ITR約0.3kb +具體啟動子 + 內(nèi)含子約0.6kb + 具體熒光標(biāo)簽 + polyA約0.2kb），所以插入目的基因一般約2kb 左右。由于AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb，可考慮去除內(nèi)含子，因為內(nèi)含子只是有助于插入的目的基因穩(wěn)定表達。

（2）確定表達蛋白的目的，然后再來選擇優(yōu)勢的表達質(zhì)粒。一般分為原核表達和真核表達質(zhì)粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達載體，就得建立相應(yīng)的純化系統(tǒng)，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一的、需要量大的蛋白。真核表達載體一般是細胞、體內(nèi)表達等需要時所用，只需要將它放到細胞或體內(nèi)細胞即可，唯一考慮的是它的啟動子的選擇，常用都是cmv啟動子的，表達效率較高，也有多種啟動子經(jīng)過改造的表達載體，一般用來表達需要調(diào)控表達時間及表達量的蛋白。

 

3、載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。

①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1-1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；

②一般使用松弛型質(zhì)粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個；

③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；

④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。

 

選擇載體還需注意：

無標(biāo)簽載體，起始/終止密碼子都要添加！

標(biāo)簽在N端的載體，終止密碼子要添加！

標(biāo)簽在C端的載體，起始密碼子要添加！

（詳細解讀如下）

①對于無起始密碼子和終止密碼子的基因，插入無標(biāo)簽的載體要加入起始密碼子和終止密碼子。

②載體N端有標(biāo)簽，上游引物要對讀碼框；下游引物要加終止密碼子(為了保證基因的表達,少翻譯載體序列) 。

鏈接：對讀碼框是為了防止移碼，是不是移碼要看載體圖譜，看酶切位點。從ATG開始，要保證三個堿基編碼的氨基酸不能影響插入目的基因的正常編碼，若影響了插入目的基因的正常編碼就要在設(shè)計引物的時候在酶切位點前或者后插入一個或者兩個堿基，總之是不能影響插入目的基因的正常編碼蛋白。有的酶切位點含有起始密碼子，如果標(biāo)簽在C端像Nco I就有一個ATG，這時候需要加堿基在酶切位點后面。

③載體C端有標(biāo)簽，上游引物要加起始密碼子，且考慮是否加Kozak序列（真核表達系統(tǒng)）；下游引物要對讀碼框，并且要去掉基因本身的終止密碼子（保證C端標(biāo)簽表達）。

鏈接：Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC（常見的序列是GCCACC），位于起始密碼子（ATG）之前。它可以與翻譯起始因子結(jié)合而介導(dǎo)含有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯起始。在真核生物中，該序列相對比較保守。對應(yīng)于原核生物的SD序列（原核基因在mRNA5’端起始密碼子AUG上游一段對mRNA的翻譯起作用的序列）。

添加Kozak序列的好處：核糖體需要Kozak序列進行穩(wěn)定結(jié)合有助于提高真核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。

 

三、改造載體

 

1、改造啟動子：一般在過表達載體中CMV屬于廣譜型的強啟動子，具體可根據(jù)實驗需求，選用不同啟動子，尤其是對于AAV載體構(gòu)建時選用組織特異性啟動子。

 

啟動子名稱	啟動子大小	組織特異性
ALB	2.4kb	肝臟特異性
CAG	944bp	廣泛表達的強啟動子
CamKIIa	1.2kb	大腦皮層和海馬神經(jīng)元特異性啟動子
CMV	0.6kb	廣泛表達的強啟動子
EF1A	1.2kb	廣泛表達的啟動子(尤其在體內(nèi)穩(wěn)定表達)
GFAP	1.0kb	星形膠質(zhì)細胞特異性啟動子
aMHC	0.4kb	心肌α肌球蛋白重鏈啟動子

 

cTNT	702bp	心肌特異性
Synapsin	471bp	成熟神經(jīng)元特異性啟動子
Rpe65	700bp	視網(wǎng)膜特異性
3Xenhancer McK	728bp	小鼠中肌肉特異性啟動子
NSE	1.3kb	神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動子

2、實驗?zāi)康牡男枰?/p>

①構(gòu)建過表達or干擾載體

根據(jù)實驗用途選擇載體，如過表達載體通常選用CMV啟動子，CMV因其集中了細胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點而具有異常高的活性，是公認(rèn)的真核表達中的增強子，一般插入某個基因的CDS區(qū)到CMV啟動子下游，CMV負責(zé)啟動該基因的表達，從而達到調(diào)高該基因表達的作用；而U6和H1更多的是用于shRNA的啟動來達到敲低一個基因的作用，U6和H1啟動子都是RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達約21個核苷酸和約50個核苷酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop），RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ到連續(xù)4個或5個T時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止。

我們公司的shRNA病毒載體（包括腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體）是由U6或H1 啟動shRNA 實現(xiàn)，并連接了報告基因，可以實時監(jiān)測載體的轉(zhuǎn)染效率。構(gòu)建干擾載體針對目的基因（目的基因需要大于0.7kb，若小于0.7kb需要評估來確保能設(shè)計出8條shRNA序列），設(shè)計并提供4個針對靶基因的shRNA產(chǎn)品，確保4個shRNA中的1個產(chǎn)品在細胞感染效率達80%以上的前提下，在mRNA水平至少有70%的沉默效果；也可以按照客戶的要求來設(shè)計，由客戶確定shRNA 序列的長度，對于每條選定的靶序列，設(shè)計正義鏈和反義鏈，以 loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)相連，合成shRNA。

②是否攜帶GFP等熒光標(biāo)簽

攜帶熒光標(biāo)簽基本目的是為了觀察感染目的細胞的效率；攜帶該標(biāo)簽的好處之一是不用破碎組織細胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達及定位情況，而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定。但是，由于GFP標(biāo)簽比較大（約720bp），這種大標(biāo)簽在位置上對目的基因造成了空間位阻作用，對蛋白的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，從而不利于目的基因蛋白本身的活性及正常功能的發(fā)揮。此外，還需要結(jié)合蛋白本身的特性，比如該蛋白為具有切割活性的蛋白，即使融合了GFP，標(biāo)簽很有可能會被破壞，終究會影響GFP的熒光及基本功能。一般不建議融合這么大的標(biāo)簽，實驗需要帶熒光標(biāo)簽，建議構(gòu)建載體時通過P2A非融合。

③是否融合6×His、HA、Myc、FLAG等小標(biāo)簽

為了做免疫共沉淀實驗或者WB檢測蛋白表達,需要加融合小標(biāo)簽。多數(shù)情況下,由于多肽標(biāo)簽相對較小，對目的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小。但是在蛋白合成肽鏈的過程中，如果影響了蛋白的折疊，也會造成目的蛋白活性的下降甚至功能的喪失。

④是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。

鏈接：啟動子：促進DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼區(qū)的上游，是DNA分子上可以與RNA聚合酶特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。

增強子：為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序，其作用與其所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。

沉默子：負增強子，負調(diào)控序列。

核糖體結(jié)合位點/SD序列：mRNA的起始AUG上游約8~13核苷酸處，存在一段由4~9個核苷酸組成的共有序列，可被16SrRNA通過堿基互補精確識別的序列被稱為核糖體結(jié)合位點/SD序列是對原核生物而言，在mRNA 5’ 端起始密碼子AUG上游一段對mRNA的翻譯

起作用的序列。

轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點下游有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號?！?/p>

3、載體中P2A和IRES的選擇：

 

	IRES和P2A的比較
	IRES	P2A
定義	IRES內(nèi)部核糖體進入位點序列：是一段約500bp的核酸序列，這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合，能獨立的起始蛋白翻譯。	P2A肽(2A peptide)是一種可"自我剪切"的短小肽鏈，最初在FMDV中發(fā)現(xiàn)，約22個氨基酸，2A肽可在蛋白翻譯時通過核糖體跳躍從自身最后2個氨基酸C末端斷裂。
優(yōu)點	IRES被放置于兩個ORF之間的時候，可以同時表達這兩個ORF。由于兩個ORF分別有自己的起始密碼子和終止密碼子，所以會翻譯兩個獨立的、沒有經(jīng)過修飾的蛋白。	兩個基因（ORF）通過2A多肽鏈連接成為一個ORF，mRNA翻譯成一個融合蛋白，但這兩個融合蛋白會被識別2A的蛋白酶切成兩個蛋白。這兩個蛋白的摩爾比理論上是1:1。
缺點	IRES的存在有時候會影響mRNA的結(jié)構(gòu)，同時由于IRES和mRNA的5’CAP對核糖體/或翻譯起始復(fù)合物的結(jié)合力不同，IRES后面的ORF翻譯蛋白的水平有可能與IRES前面的ORF蛋白水平不一致。有的時候前面的ORF表達很好，但后面的ORF表達水平不高；有的時候后面的ORF和/或IRES會影響前面ORF的表達，甚至前面的ORF根本不表達。	2A是一個大約22個氨基酸的多肽。蛋白酶切割會發(fā)生在2A多肽C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之間。所以，前一個蛋白的尾巴上會留下一個20多個氨基酸的多肽。后面一個蛋白的N端會留下一個多余的脯氨酸。尤其是第一個蛋白，如果是一個小分子（比如分泌型的細胞因子），可能其功能會受到這20多個氨基酸的影響。
建議	IRES序列后基因的表達效率顯著低于IRES序列前基因的表達，所以與IRES相比，2A肽具有以下優(yōu)點：（1）2A序列短，能夠有效地實現(xiàn)連接基因之間的共表達；（2）位于2A下游的基因同樣可以獲得很高的表達水平。

 

四、影響載體選擇的因素：

 

? 原核表達 or 真核表達

? 細胞實驗 （過表達 or 干擾、瞬時表達 or穩(wěn)轉(zhuǎn)株、基因大小、熒光、藥篩 ）

?動物實驗 （過表達 or 干擾、注射部位、基因大小、觀察周期 ）