三種細胞免疫熒光染色操作步驟

免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光，下文主要列舉了三種細胞免疫熒光染色的實驗步驟。
 
一、zo-1的免疫熒光，步驟如下：

1. 細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出。

2. 用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。

3. 4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。

4. 1×PBS洗3次，每次10分鐘。

5. 0.2%Triton X-100透化2-5分鐘。

6. 1×PBS洗3次，每次10分鐘。

7. 5%BSA室溫封閉30分鐘。

8. 加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。

9. 1×PBS洗3次，每次10分鐘。

10. 加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光。

11. 1×PBS洗3次，每次10分鐘。

12. 95%甘油封片。

注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋。

二、細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：

1. 取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。

注意：有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。

4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5. 一抗4度濕盒內過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。

6. 二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。

7. 最好用DAPI染核，然后直接照熒光片。

8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。

建議：

1. 還是染完之后沒有封片前直接照一些，因為有的時候可能封片會出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會崔滅的。

2. 熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時間仍然能照出很好的片子。

3. 二抗用之前一定離心，不然有的時候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點，非常難看。

三、細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：

1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。

2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。

3. PBS洗凈：3min×3。

4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。

5. PBS洗凈：2×5 min。

6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。

7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。

8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。

9. 二抗37度小于一小時。

10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。

11. 涼干封片（封閉液PH8.5）

不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時.