3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，你了解多少呢？

    你知道嗎？細胞在平面上生長是人為且不自然的，因為這與細胞能夠以最佳狀態(tài)進行旺盛生長的體內(nèi)環(huán)境并不相同。所以，傳統(tǒng)的2D單層細胞培養(yǎng)物很難恰當?shù)胤从吵黾毎捏w內(nèi)生長環(huán)境，進而可能造成細胞結(jié)構(gòu)和組織功能的缺失。

    三維（3D）細胞培養(yǎng)技術(shù)能夠更好地模擬生物體內(nèi)細胞存活的自然環(huán)境，其自然條件可保持細胞間相互作用和更逼真的生化和生理反應(yīng)。在3D環(huán)境中，細胞對內(nèi)源性和外源性刺激（如溫度、pH、營養(yǎng)吸收、轉(zhuǎn)運和分化等方面的改變）應(yīng)答更接近于它們在體內(nèi)的反應(yīng)。再生醫(yī)學(xué)的力量為理解發(fā)育、老化和組織年輕化等許多有趣的細胞進程提供了方法，了解生物學(xué)中這些有趣過程的唯一方法就是研究與生物體非常相似的模型系統(tǒng)，這使得3D細胞培養(yǎng)成為必不可少的研究工具。

    3D細胞培養(yǎng)技術(shù)使諸多科研工作者從中受益。在過去十年里，研究人員不斷開發(fā)出更多3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，從而可以在體外保持細胞的天然3D結(jié)構(gòu)，改善細胞培養(yǎng)環(huán)境，輔助它們生長于更接近體內(nèi)的環(huán)境條件中。

    那么小編來考考你，目前都有哪些3D細胞培養(yǎng)技術(shù)呢？一起來看一下吧！
    3D細胞培養(yǎng)技術(shù)有很多，但總結(jié)起來可分為3類：

    第1類：3D水凝膠

    基本原理：

    水凝膠是水膨脹性的高分子網(wǎng)絡(luò)，被設(shè)計用來模擬復(fù)雜的細胞外微環(huán)境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長因子組成。用于三維細胞培養(yǎng)的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的ECM聚合物，新一代的合成、混合或基于多肽的材料則可制備滿足特定需求的培養(yǎng)環(huán)境，為每個細胞和應(yīng)用需求提供最合適的選擇。

    技術(shù)舉例：

    1.1 天然水凝膠

    ECM凝膠：從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的天然ECM，可提供非常豐富的營養(yǎng)，與細胞的發(fā)育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過20-40℃熱激活，凝膠化過程也是可逆的（蛋白質(zhì)濃度：8-12mg/ml）。

    MaxGel胞外基質(zhì)：MaxGel人細胞外基質(zhì)源于體外培養(yǎng)的細胞基底膜，含有可預(yù)測的低水平內(nèi)源生長因子，更適合需要更明確和特征再造BME的應(yīng)用，最終可降低實驗的可變性。MaxGel人細胞外基質(zhì)（ECM）含有多種細胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白、層粘蛋白、纖連蛋白、腱生蛋白、彈性蛋白以及大量的蛋白聚糖及粘多糖等。用于細胞培養(yǎng)的ECM可以高效地重現(xiàn)上皮細胞與間質(zhì)在皮膚發(fā)育及器官型細胞培養(yǎng)過程中的協(xié)同作用。MaxGel可以促進細胞生長和遷移，已被證實可以促進多種類型細胞的增殖，包括神經(jīng)干細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

    Cultrex3-D培養(yǎng)工具： 3-D Culture MatrixTM RGF BME低生長因子基底膜抽提物，經(jīng)過效果驗證，專為滿足三維培養(yǎng)研究的需求而研制。為了提供最標準化的3D培養(yǎng)基底膜抽提物產(chǎn)品，采用一套特殊工藝來降低生長因子以更好的保證批間一致性，并將基質(zhì)的標準濃度控制在15 mg/ml左右，隨后在三維培養(yǎng)條件下對本品的效能進行評估驗證。

    在3-D Culture MatrixRGF BME中培養(yǎng)16天后，對MCF-10A細胞進行染色：細胞染色試劑盒（結(jié)構(gòu)）；B）SYBR?Green（細胞核）；C）MitoShift?（線粒體膜電位）；

    3-D Culture MatrixRGF BME中培養(yǎng)12天后，對PC-3細胞進行染色：D）Calcein AM（細胞活力）；E）CPA染料1（細胞核）；F）Depsipher?（線粒體膜電位）

    天然水凝膠技術(shù)優(yōu)勢：

    建立已久，支持文獻和應(yīng)用較多

    提供天然生物配體

    通常含有生長因子和細胞因子

    1.2 合成水凝膠

    HyStem細胞培養(yǎng)支架——首款定制合成的ECM

    HyStem產(chǎn)品是首個可定制的合成ECM，與體內(nèi)條件非常相近。使用HyStem平臺，研究人員可控制生長因子、黏附因子和ECM蛋白的摻入、水凝膠硬度及細胞囊化等。由于HyStem 是一種合成的基質(zhì)，而不是生物提取物，所以研究人員能夠密切控制細胞環(huán)境的組成。HyStem的成分包括化學(xué)合成的HyStem（巰基化透明質(zhì)酸）、Extralink?（硫醇反應(yīng)性交聯(lián)劑）、脫氣的水和生物純化的Gelin-S?（變性膠原蛋白）干細胞的天然環(huán)境富含透明質(zhì)酸，因此，HyStem試劑盒是培養(yǎng)干細胞的最佳選擇。HyStem水凝膠支架精密模仿了天然的細胞外基質(zhì)環(huán)境，含有豐富的透明質(zhì)酸和膠原纖維，同時具有定制靈活性，能加入適當?shù)纳L因子、附著因子和蛋白。

    HydroMatrix多肽水凝膠

    HydroMatrix水凝膠是一種合成多肽納米纖維支架，通過高度交聯(lián)的多肽水性凝膠中的天然三維結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)對合成基質(zhì)的精確控制。HydroMatrix支架可以在溫度或離子強度變化刺激下從液態(tài)前體自組裝為高度交聯(lián)的三維多肽水性凝膠。通過調(diào)整HydroMatrix溶液的濃度，研究人員可以控制3-D結(jié)構(gòu)的柔韌性，并對結(jié)構(gòu)進行剪裁以滿足個人需求。HydroMatrix?可以促進細胞生長和遷移，已被證實可以促進多種類型細胞的增殖，包括神經(jīng)干細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

    HydroMatrix多肽水凝膠可支持極佳的細胞生長環(huán)境。大鼠神經(jīng)干細胞(NSCs)在3種平面上進行培養(yǎng)：NSCs在組織培養(yǎng)塑料平面生長很差(A)，在多聚賴氨酸/層粘蛋白處理的平面上長勢稍好(B)，但在0.5% (w/v)的HydroMatrix多肽水凝膠上表現(xiàn)出極佳的生長狀態(tài)(C)。

    合成水凝膠技術(shù)優(yōu)勢：

    明確無動物源成分和病原物

    無生長因子，無批間差異

    可通過額外添加特異的生物相關(guān)氨基酸序列實現(xiàn)進一步功能化

    第2類：細胞聚集

    基本原理：

    基于細胞聚集的方法不需要額外添加細胞外基質(zhì)蛋白，細胞會產(chǎn)生內(nèi)源的細胞外基質(zhì)蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細胞數(shù)量、孵育時間和細胞增殖率等因素。

    技術(shù)舉例：

    2.1懸滴培養(yǎng)板

    Perfecta3D懸滴培養(yǎng)平板的孔板經(jīng)過特殊設(shè)計，當在小孔上方加入一滴細胞懸液時，孔板的幾何構(gòu)造就會引導(dǎo)細胞和培養(yǎng)基通過一個小洞，進而形成一個穩(wěn)定的懸滴。滴入口位于每個培養(yǎng)孔的上方，可用來更換培養(yǎng)基，添加外源胞外基質(zhì)、生長因子、小分子，也可用來加入細胞形成混合培養(yǎng)物。Perfecta3DM懸滴培養(yǎng)板每孔形成一個球體，且可控制球體大小以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。 96孔和384孔懸滴培養(yǎng)板與自動化液體處理設(shè)備、微孔板讀數(shù)儀等兼容。

    懸滴培養(yǎng)板技術(shù)優(yōu)勢：

    球體大小和數(shù)量可控制，孔間數(shù)據(jù)可重復(fù)

    可使用液體處理系統(tǒng)實現(xiàn)自動化

    使用較大球體可模擬缺氧狀態(tài)

    提供細胞混合的靈活性，種植前或球體形成后即可

    2.2低粘附平面

    Corning極低吸附平面是一種共價偶聯(lián)了水凝膠的親水不帶電平面，以盡可能的降低細胞貼附、蛋白吸收和酶活性，維持細胞以懸浮不貼壁的狀態(tài)生長。

    低粘附培養(yǎng)平面技術(shù)優(yōu)勢：

    可形成較大的球形體

    U型或V型底的96/384孔平板每孔可產(chǎn)生單個球體

    2.3 3D PetriDish

    MicroTissues 3D 培養(yǎng)皿是不基于支架的天然3D 細胞培養(yǎng)環(huán)境，可最大限度模擬細胞間的相互作用和信號交流。該產(chǎn)品線包括多種規(guī)格的微組織培養(yǎng)系統(tǒng)，適配標準的12孔和24孔培養(yǎng)板，可應(yīng)用于形成球狀體、乳腺癌細胞球、膠質(zhì)瘤細胞球、肝細胞球、軟骨細胞球、骨細胞球、神經(jīng)細胞球、心肌細胞球，以及細胞聚集體和擬胚體等多種細胞培養(yǎng)模式。

    3D 培養(yǎng)皿制備流程圖

    3D 培養(yǎng)皿技術(shù)優(yōu)勢：

    單次移液操作即可獲得上百個相同大小的球體

    可從單細胞克隆形成球體

    可在同一平面對一組球體進行成像

    可形成復(fù)雜形態(tài)的微組織

    第3類：培養(yǎng)支架

    基本原理：

    支架可提供一種物理支撐，細胞可以進入支架生長和行使功能?？紫斗植肌⒈┞镀矫鎱^(qū)域和孔隙度具有關(guān)鍵作用，其數(shù)量和分布會影響細胞滲透入支架的效率，而依據(jù)不同的制作工藝，支架具有不同的結(jié)構(gòu)、隨機或定制的孔隙分布。

    支架可以通過包被或功能化以產(chǎn)生不同的特性和影響細胞的生長和行為，且有些“支架”技術(shù)還和“水凝膠”技術(shù)有著密切的關(guān)系。

    技術(shù)舉例：

    支架的種類很多，基本可以分為：1. 天然支架如膠原、明膠、纖維蛋白、幾丁聚糖、粘多糖、瓊脂糖和海藻酸等，天然支架具有生物兼容性，但穩(wěn)定性較差；2. 合成支架如聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚氨酯等，合成材料具有一致性、穩(wěn)定性，但惰性、堅硬，生物兼容性較差。

    培養(yǎng)支架技術(shù)優(yōu)勢：

    可實現(xiàn)器官型共培養(yǎng)-模擬分層的組織結(jié)構(gòu)

    與現(xiàn)有的塑料制品格式和下游分析方法兼容

    結(jié)構(gòu)一致具有可重復(fù)性，兼容高通量

    小結(jié)：不同3D細胞培養(yǎng)技術(shù)都各有優(yōu)勢和不足，因此在選擇合適的3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)時需要考慮多方面因素，比如要解決的問題或研究目的、實驗?zāi)Ｐ?、細胞類型、技術(shù)可實現(xiàn)性、下游分析方法和樣品數(shù)量等。