你知道喂給細(xì)胞的培養(yǎng)基成分去哪了嗎？

我們做科研的，大多數(shù)人都養(yǎng)過(guò)細(xì)胞，細(xì)胞樣本實(shí)驗(yàn)周期短，成本低，我們?cè)陴B(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候不可避免的要用到培養(yǎng)基，比如微生物用到的 LB, M9 等，動(dòng)物細(xì)胞用到的 DMEM 等，每種培養(yǎng)基的成分都不盡相同，那么你有沒(méi)有考慮過(guò)，培養(yǎng)基是如何給細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)的呢？那些 C 源 N 源到底是怎么維持細(xì)胞生長(zhǎng)的呢？我們今天要分享的這篇文獻(xiàn)，就以谷氨酰胺為例，使用同位素追蹤的方法給大家展示在缺氧條件下，谷氨酰胺作為 C 源是如何維持腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的。

部分 介紹谷氨酰胺的重要性

當(dāng)然了，先證明谷氨酰胺對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)是很重要的，再來(lái)研究他的代謝，沒(méi)毛病。
 

首先用添加了不同濃度、不同成分的培養(yǎng)基（Glu，AUCG，各種氨基酸）培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中若沒(méi)有谷氨酰胺，細(xì)胞死亡率會(huì)顯著上升，而添加了 AUCG 的培養(yǎng)基可以在谷氨酰胺缺失的情況下抑制細(xì)胞的死亡，說(shuō)明谷氨酰胺與核苷的合成有關(guān)。由此，作者推論，谷氨酰胺是細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的物質(zhì)。

那么在缺氧條件下細(xì)胞會(huì)將谷氨酰胺作為 C 源維持生長(zhǎng)，但是谷氨酰胺也是生物體的 N 源，那么細(xì)胞會(huì)如何處理隨之而來(lái)的高濃度的 N 呢？
 

在缺氧條件下谷氨酰胺被用來(lái)做為主要的 C 源，尤其是脂質(zhì)合成。
 

由上圖 b 可知缺氧條件下細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺（Gln）吸收增加了。通過(guò) 13C-Gln 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)前體 Ac-CoA 增加了（圖 c，m+0 減少，m+2 增加），其他下游物質(zhì)如氨基酸等也增加了（圖 d，e）。這些數(shù)據(jù)表明缺氧時(shí)谷氨酰胺作為 C 源吸收增加了。接下來(lái)，作者試圖找到谷氨酰胺的 N 代謝。谷氨酰胺可以脫去氨基生成 NH3，但是對(duì)培養(yǎng)基的檢測(cè)發(fā)現(xiàn) NH3 的量沒(méi)有升高反而下降了（圖 f），NH3 可以被代謝成尿素，但是培養(yǎng)基中尿素的含量卻下降了（圖 g），因此谷氨酰胺的 N 應(yīng)該是被其他物質(zhì)利用了。
 

第二部分 研究谷氨酰胺的代謝

通過(guò)在缺氧條件下的含 N 代謝物的篩選，得到了 6 個(gè)顯著升高的物質(zhì)，11 個(gè)顯著下降的物質(zhì)。其中，五個(gè)顯著上調(diào)的物質(zhì)：IMP、DOHA、OA、鳥(niǎo)嘌呤和肌苷參與了 nucleotide biosynthesis 通路，驗(yàn)證結(jié)果也表明在 HeLa、MCF-7 和 4T1 細(xì)胞中 IMP（AMP 和 GMP 的前體）、carbamoyl-Asp、DHOA、OA 都顯著升高。這些結(jié)果表明缺氧導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)核苷酸的前提累積，尤其是嘧啶前體，包括 carbamoyl-Asp、DHOA 和 OA。

?缺氧條件下谷氨酰胺的 N 富集在 DOHA 和 OA 上
 

作者使用 N15 標(biāo)記的谷氨酰胺來(lái)追蹤 N 的吸收。由上圖可知，酰胺基（Amine）上的 N 會(huì)轉(zhuǎn)移到 Asp、DOHA、OA、UMP、IMP 上，而氨基（Amide）上的 N 會(huì)轉(zhuǎn)移到 DHOA、OA、UMP、IMP 上。
 

在缺氧條件下，標(biāo)記的 DHOA 和 OA 含量顯著上升，說(shuō)明谷氨酰胺的 N 富集于 DHOA 和 OA 上，但是 DHOA 和 OA 的代謝效率不高，因?yàn)橄掠萎a(chǎn)物 UMP 含量沒(méi)有增加。
 

標(biāo)記的 N 還可以在氨基酸中檢測(cè)到，但是在缺氧條件下，被標(biāo)記的氨基酸含量都沒(méi)有升高，因此這些數(shù)據(jù)可以證明缺氧條件下谷氨酰胺的 N 富集于 DHOA 和 OA 上而不是氨基酸上。

?缺氧條件下促使天冬氨酸作為嘧啶前體
 

由上圖可知，谷氨酰胺的 C 在通過(guò) TCA 循環(huán)和 α- 酮戊二酸羧化還原途徑轉(zhuǎn)移到天冬氨酸之后可以被合成為嘧啶。這兩條途徑可以通過(guò)檢測(cè) C13-Gln 來(lái)源的乙酰輔酶 A，天冬氨酸，檸檬酸，DHOA 和 OA 來(lái)區(qū)分。正常條件下，谷氨酰胺的 C 進(jìn)入 TCA 循環(huán)，可以生成 M+4 的 Asp，檸檬酸，DHOA 和 OA；在缺氧條件下，生成 m+2 的乙酰輔酶 A，m+3 的天冬氨酸，m+5 的檸檬酸，m+3 的 DHOA 和 OA 通過(guò)還原途徑生成；m+3 的 UMP 可以由兩條途徑都生成。
 

由上圖結(jié)果可知缺氧條件下谷氨酰胺的 C 通過(guò)還原途徑進(jìn)入了乙酰輔酶 A、DHOA 和 OA，并且含量有所升高，因此缺氧條件促進(jìn)了他們的合成。但 DHOA 的直接前體：天冬氨酸含量卻降低了，這可能與嘧啶合成通路中多個(gè)酶參與有關(guān)，為研究這個(gè)現(xiàn)象，作者使用 C13,15N-Asp 來(lái)追蹤天冬氨酸在嘧啶合成中的代謝。
 

由上圖可知，檢測(cè)到了 m+5 的 Asp 表明細(xì)胞完全可以吸收外源的 13C-15N-Asp（圖 a），也檢測(cè)到了 15N-m+1 的谷氨酸和天冬氨酸，13C-m+4 的天冬氨酸（圖 a，b）；缺氧使細(xì)胞吸收更多的天冬氨酸，有趣的是，正常條件下細(xì)胞并不能產(chǎn)生很多的 DHOA 和 OA, 但是在缺氧條件下 DHOA 和 OA 的含量都升高了（m+4，m+5 顯著升高），而且 m+4 的天冬氨酸生成 m+5 的 DHOA 和 OA 效率更高了，因此缺氧使天冬氨酸到 DHOA 和 OA 的途徑活性升高了，這也導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的天冬氨酸含量降低。

?DHOA 和 OA 是細(xì)胞生長(zhǎng)必須的嗎？
 

從上述結(jié)果來(lái)看，缺氧條件下大部分的谷氨酰胺都生成了 DHOA 和 OA，那么他們對(duì)細(xì)胞生存是必須的嗎？作者對(duì) DHOA 和 OA 通路上的酶做了 knockdown，如 CAD、DHODH、GOT1。 
 

DHODH 和 CAD 是嘧啶合成的關(guān)鍵酶，因此他們的 knockdown 即使在正常條件下也明顯的影響了細(xì)胞的分化。相反的是，缺氧條件下，GOT1 的敲除輕微地影響了細(xì)胞的分化。而 CAD 和 GOT1 的敲除讓細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)，DHODH 的敲除只是稍微影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。這說(shuō)明對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)，DHOA 才是不可缺少的，而不是 OA。
 

CAD 和 GOT1 的敲除顯著降低了 DHOA 和 OA 的含量（圖 e，f），同時(shí)也減少了 α- 酮戊二酸，檸檬酸和乙酰輔酶 A 的含量（圖 g）。雖然天冬氨酸可以合成 DHOA 和 OA，外源添加天冬氨酸也并沒(méi)有使 DHOA 和 OA 的量增加（圖 e，f）。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明谷氨酰胺的 C 代謝和 N 代謝都與 DHOA 有關(guān)。
 

為了確認(rèn)這個(gè)假設(shè)，使用 α- 酮戊二酸（C 來(lái)自谷氨酰胺）處理細(xì)胞，結(jié)果顯示 α- 酮戊二酸的添加可以減少谷氨酰胺的吸收（圖 d），幾乎完全清除了 DHOA 和 OA 的積累（圖 h，i），并且抑制了 DHOA 的分泌（圖 j）。尿苷和 α- 酮戊二酸的添加可以使敲除酶的細(xì)胞增值增加，但是單獨(dú)添加尿苷不能，單獨(dú)添加 α- 酮戊二酸或添加 α- 酮戊二酸和尿苷可以升高細(xì)胞的增殖，這些結(jié)果表明谷氨酰胺的 C 代謝對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)是必要的，并且取決于 DHOA 的合成。

總結(jié)一下

通過(guò)同位素追蹤，文章展示了一條在缺氧條件下的谷氨酰胺通路，找到了缺氧條件下腫瘤細(xì)胞中的代謝變化，找到了谷氨酰胺的代謝產(chǎn)物 DHOA 和 OA, 并在病人和小鼠中也檢測(cè)到了升高的 DHOA 和 OA，因此他們可以作為腫瘤的潛在標(biāo)志物，通路上的酶如 CAD 和 GOT1 可以作為腫瘤治療的可能目標(biāo)。

怎么樣，代謝流的結(jié)果是不是很強(qiáng)大呢？

它可以為我們提供更直接的證據(jù)來(lái)說(shuō)明問(wèn)題，在基因工程和不同環(huán)境或不同代謝途徑中找到關(guān)鍵通路及代謝功能變化方面提供強(qiáng)有力的證據(jù)。