我們將著重介紹 Strep-tag? 在哺乳類細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。
雖然大腸桿菌 E.coli 表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,但由于缺乏重要的脂類,分子螫合物,以及重要的翻譯后修飾,用它表達(dá)真核蛋白,可能會(huì)影響蛋白本身的折疊及功能,以膜蛋白為例,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能影響目標(biāo)蛋白在細(xì)胞膜的插入位置、及其應(yīng)有的功能[1]。除此之外,當(dāng)目標(biāo)蛋白大于 50kDa 時(shí),使用大腸桿菌系統(tǒng)可能表達(dá)出不完整的蛋白[2]。
所以,為了研究特定蛋白的功能(如:信號(hào)通路)、生產(chǎn)較大型的蛋白,或進(jìn)行高解析度的結(jié)構(gòu)分析,愈來愈多的實(shí)驗(yàn)組選擇哺乳類表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)融合蛋白。其原因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)出的重組蛋白與人類蛋白十分相似,有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯后修飾[3]。因此,愈來愈多科學(xué)家們更加關(guān)注于—如何從哺乳類細(xì)胞中的純化目標(biāo)蛋白。
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親和標(biāo)簽的選擇
首先,需考慮選擇合適的親和標(biāo)簽。常用于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的親和標(biāo)簽有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag? 等[4-12],整理于下表:
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這些親和標(biāo)簽在使用上各有千秋。
使用 His-tag 時(shí),常遇到的問題是寄主蛋白與填料的非特異性結(jié)合,在哺乳動(dòng)物重組蛋白的純化過程中,這樣的情況更為明顯。由于系統(tǒng)中有很多含有組氨酸(histidine)的殘基的蛋白,這種蛋白結(jié)構(gòu)與 his-tag 相似,容易與鎳柱結(jié)合,因此導(dǎo)致目標(biāo)蛋白純度降低[13]。
FLAG-tag 系統(tǒng)可在非變性條件下進(jìn)行純化,能得到高純度、有活性的蛋白,但其缺點(diǎn)為純化介質(zhì)較為不穩(wěn)定,且純化成本高上許多[5]。
另一常用的標(biāo)簽為 GST-tag,一個(gè) 26kDa 的蛋白,其特點(diǎn)是表達(dá)量高,具高度抗原性,常用來增加目標(biāo)蛋白的溶解度,但常常會(huì)影響目標(biāo)蛋白的特性,一般推薦純化后將標(biāo)簽去除[8]。
而 Strep-tag?(包含 Strep-tag?II或是 Twin-Strep-tag?),都是短肽標(biāo)簽,分別為 8 或 28 個(gè)胺基酸,一般不干擾蛋白折疊或活性,因此適合用于蛋白功能性研究[5]。Strep-tag? 可以特異性的結(jié)合在 Strep-Tactin? (二代介質(zhì)) 或 Strep-Tactin?XT (三代介質(zhì)) 的生物素的結(jié)合位點(diǎn)。洗脫時(shí)使用的脫硫生物素(適用于二代)或生物素(三代),對(duì)同樣的結(jié)合位點(diǎn)有更高的親和力,能將目標(biāo)蛋白從同樣位置移除,因此得到的目標(biāo)蛋白純度一般高于 95%[12]。
同時(shí),三代 Strep-Tactin?XT 與 Strep-tag? 蛋白的親和力大幅提升,直接加入含目標(biāo)蛋白的哺乳細(xì)胞的培養(yǎng)上清,即可純化出所需蛋白(注: 原本使用二代需先以 Avidin 或是 BioLock 將培養(yǎng)基中的生物素遮蔽,才不會(huì)影響純化表現(xiàn))。
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三代 Strep-Tactin?XT 親和力顯著
圖 A 比較了 His-tag 與 Strep-tag? 直接加入哺乳細(xì)胞培養(yǎng)上清的純化目標(biāo)蛋白的表現(xiàn)。
圖 A
圖 A:分別向 Strep-Tactin?XT High Capacity 1ml 重力柱(左)和 Ni-NTA 1ml 重力柱(右)中,同時(shí)加入含 4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或 mCherry-His-tag (His) 螢光蛋白的 ExpiCHO 細(xì)胞培養(yǎng)上清(注: 接下來的實(shí)驗(yàn)皆是取哺乳細(xì)胞表達(dá)某抗體后的上清,另加入高純度目標(biāo)蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。由圖可見,Strep-Tactin?XT(左)能率的捕捉 mCherry-TST,而右方的 mCherry-His 幾乎無法掛柱。
此外,我們也測(cè)試了其他的蛋白,例如 SEAP (72 kDa) 或抗體 (mAb,其重鏈為 55 kDa)。圖 B 為以 Strep-Tactin?XT 純化 SEAP-TST、mCherry-TST與 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析結(jié)果,可見對(duì)于不同蛋白,Strep-tag? 系統(tǒng)都能純化出高純度的目標(biāo)蛋白。(注: 紅色標(biāo)記處為 mCherry 的降解產(chǎn)物,非雜帶)
圖 B
因 Strep-Tactin?XT 與 Twin-Strep-tag 蛋白的高親和力,即使目標(biāo)蛋白的濃度低,使用 Strep-Tactin?XT 仍可以有效的捕捉上清中的目標(biāo)蛋白。表 C 整理了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù),顯示當(dāng)目標(biāo)蛋白濃度低于 20 μl/ml 時(shí),得率仍能達(dá)到幾近 100%。
表 C
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Strep-Tactin?XT 普適性高
除了上述實(shí)驗(yàn)所用的 CHO 細(xì)胞株外(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞),另一常用于生產(chǎn)蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株為 HEK293(人胚胎腎細(xì)胞),使用上較 CHO 簡(jiǎn)單。我們測(cè)試了 Strep-Tactin?XT 的純化表現(xiàn) : 表 D1 為以 Expi293 表達(dá) SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后,目標(biāo)蛋白的濃度。圖 D2 為純化表現(xiàn)的 SDS-PAGE 分析。從中可知,與 ExpiCHO 培養(yǎng)基相同,直接將表達(dá)好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin?XT 高載量重力柱中進(jìn)行純化,一樣能夠快速的得到高純度的目標(biāo)蛋白。
表 D1
圖 D2
綜上所述,Strep-tag? 非常適合用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)目標(biāo)蛋白,其純化過程也與常見的 ExpiCHO 及 Expi293 培養(yǎng)基相容,不須另外處理,讓實(shí)驗(yàn)流程更為便利。加上 Strep-tag? 系統(tǒng)在純度上的優(yōu)勢(shì),是目前在這個(gè)應(yīng)用上的選擇。