動物檢疫基因組DNA標準樣品的研制方案簡介

隨著經(jīng)濟全球化進程的加快和進出口貿易的發(fā)展，世界各國人員往來、物資交流越來越頻繁，境外動物疫病傳人我國的危險性和可能性也隨之增大。據(jù)世界動物衛(wèi)生組織發(fā)表的公報報道，目前全球各種疾病中的60％來自動物，在所有動物引發(fā)的各種傳染病中，75％的疾病能傳染給人。在人類近現(xiàn)代史上，一些人畜共患病曾造成了巨大的災難，如鼠疫、炭疽、SARS、禽流感等。不少人獸共患病都具有傳播快、死亡率高、危害嚴重等特點，對國民經(jīng)濟的發(fā)展和整個社會的穩(wěn)定都產生極其嚴重的影響。所以，做好人畜共患病的監(jiān)測和快速篩選溯源工作，尤其是分子生物學檢驗技術．是保護人畜生命安全，應對緊急疫情的發(fā)生和動態(tài)的疫源地疫情監(jiān)測的有力手段。

核酸檢測技術是一大類依據(jù)分子生物學原理檢測DNA或RNA的技術，1985年聚合基鏈式反應的發(fā)明標志著它的誕生。經(jīng)過多年發(fā)展．核酸檢測技術已派生出包括恒溫擴增技術和核酸雜交在內的多種方法，在動物檢疫領域的病原體檢測中得到廣泛應用。分子生物學技術檢測致病菌需要準確、可溯源的標準樣品用于檢測方法的研究、確認和驗證，核酸標準樣品是分子生物學檢驗技術不可缺少的重要陽性對照物和質控物。因此．核酸標準樣品的研制是隨著分子生物學檢測技術的發(fā)展，最近十幾年才發(fā)展起來的一門新興產業(yè)。核酸標準樣品研制的關鍵技術主要包括大批量高純度核酸提取、核酸的準確定值、冷凍干燥、均勻性和穩(wěn)定性分析、溯源性等。

第二節(jié) 動物檢疫基因組DNA標準樣品的研制方案簡介

一、國內外研究現(xiàn)狀

我國已經(jīng)研制出和動物檢疫有關的致病菌基因組DNA標準樣品包括：金黃色葡萄球菌核酸標準樣品、阪崎腸桿菌核酸標準樣品、溶血性鏈球菌核酸標準樣品、肉毒梭菌核酸標準樣品、產氣莢膜梭菌核酸標準樣品、蠟樣芽孢桿菌核酸標準樣品、四種致病性大腸埃希氏菌核酸標準樣品、空腸彎曲菌核酸標準樣品、腸炎沙門氏菌核酸標準樣品、副溶血性弧菌I葺核酸標準樣品和單核細胞增生李斯特氏菌核酸標準樣品等。

國際上已經(jīng)研制出和動物檢疫有關的致病菌基因組DNA標準樣品包括：歐共體的參考物質和測量研究所(IRMM)研制的單核細胞增生李斯特氏菌基因組核酸標準樣品(IRMM- 447)、空腸彎曲菌基因組核酸標準樣品(IRMM一448)、大腸埃希氏菌O157：H7基因組核酸標準樣品(IRMM一449)。

二、制備基因組DNA標準樣品的操作步驟

(一)茵株收集、鑒定和增茵培養(yǎng)

用相應的方法對收集的標準菌株進行增菌培養(yǎng)和生化鑒定、血清凝集和特異性基因片段的PCR擴增實驗．結果符合的則用相應的標準方法進行增菌培養(yǎng)。

(二)基固組DNA提取

4℃下離心收集培養(yǎng)好的菌液并用于DNA提取，基因組DNA提取可以用商業(yè)化的核酸提取試劑盒．如AB公司生產的PrepManTM Ultra或QIAGEN公司生產的Genmictips 500 /G和Genomic DNA Buffer Set。DNA提取物溶解在pH 8．0的TE緩沖液中，并在一20℃下保存?zhèn)渑蟆?/span>

用于制備基因組DNA標準樣品的DNA相對分子質量應盡可能大，因此核酸提取過程中應特別小心：首先，在抽提過程中，不可避免的機械剪切力必將切斷DNA，因此在提取過程中應盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA分子的可能性；其次，分子熱運動也會減少所抽提到DNA的分子量，所以提取過程也應盡可能在低溫下進行；最后．因為細胞內及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程使用的玻璃器皿、試劑，離心管等一次性用品都應經(jīng)過嚴格的消毒滅菌．破壞核酸酶的活性。另外制備的基因組DNA必須是高純度的，因此制備的樣品必須沒有蛋白質和RNA污染，各種離子濃度也應符合要求，這些在基因組DNA制備時都應考慮到。

(三)基因組DNA標準樣品制備

1．基因組DNA濃度測定

以λ噬菌體DNA為外標物。采用PicoGreen DNA分子熒光定量方法測定提取的基因組DNA濃度。對于分析物濃度為50 ng／mL時，PicoGreen DNA分子熒光定量方法測量的變異系數(shù)CV=2．4％。PicoGreen DNA分子熒光定量檢測步驟為：

(1)DNA標準曲線制備

1)100μg /mL的x噬菌體DNA標準品，用pH 8.0的TE緩沖液稀釋成2 μg/mLDNA貯存液。

2)2μg /mL的x噬菌體DNA標準品貯存液按表3-1進行稀釋。

3)每個反應孔按表3-1所示．再加入1 mLQuant—iTTM PicoGreen試劑，混勻，在室溫避光孵育2 min～5 min。

4)多功能酶標儀檢測。

(2)待測樣品檢測

1)取待測樣品溶液5 μL，用pH 8.0的TE緩沖液稀釋至1mL加入反應孔中

2)每個反應}L再加入1 mL Quant一iTTM PicoGreen試劑．混勻，在室溫避光孵育2 min～5 min。

3)多功能酶標儀檢測。

(3)反應參數(shù)

多功能酶標儀檢測反應參數(shù)：激發(fā)光480 nm．發(fā)射光525 nm。

(4)結果計算

反應結束后，確認標準品和待測樣品扣除空白對照后的熒光值。以標準品的熒光值為X坐標軸，標準品的DNA濃度為縱坐標，制作標準曲線。根據(jù)待測樣品中核酸DNA的熒光吸收值．從DNA標準曲線上，得出待測樣品中DNA的濃度。

2．基因組DNA的質量檢查

取10．0 μL DNA提取物和PCR擴增產物進行電泳檢查．0．8％瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產物用1．2％瓊脂糖凝膠)，在電壓為180 V條件下電泳30 min，電泳條帶如果清晰明亮、條帶單一、無雜帶和RNA，則說明提取的DNA質量很好．核酸具有完整性和高分子量．可以用于核酸標準樣品研制。

3．基因組DNA的分裝及冷凍干燥

將上述基因組DNA分裝于內置微量管的樣品套管中，每管DNA含量為50μL，置于凍干機中冷凍干燥，如德國CHRIST公司生產的Christ Epsilon 2-85D凍干機(Chmt Ge-firertrocknungsanIagen GmbH，Osterode am Harz，DE)．使用儀器內部程序ˊ15食品-PCR細菌DNA方法進行凍于。凍干后的樣品在無菌條件下密封并加貼唯一性標識，放置于-20℃中避光貯存。

來源：北京標準物質網(wǎng)