獻給初學者：如何在細胞中穩(wěn)定表達基因

下面以 plex-MCS 載體為例。

1. 選擇酶切位點，為了避免移碼突變，上游的酶切位點選擇起始密碼子 ATG 前面的 spel，下游選擇 xho1。
2. 構建方法的選擇。

連接法
對于連接法，首先設計引物將目的基因 PCR 出來，即酶切位點加基因引物，此時應注意，為了防止酶切將基因破壞，通常習慣在兩端加入保護堿基。
盡量選擇分數較高的保護堿基。
以 PKM2 基因為例，設計引物，首先查找它的序列
選擇目的基因的種屬來源。
選擇目的基因的亞型。
查找到目的基因的 CDS 序列，以 FASTA 格式導出。
那么 PKM2 上下游引物分別為：
設計好引物后，通過 PCR 方法擴增目的基因，隨后膠回收，同樣使用 spe1 和 xho1 進行雙酶切，回收后產物與載體酶切回收產物連接即可。

重組法
對于重組法，首先設計引物將目的基因 PCR 出來，即同源臂加基因引物，此時應注意，同源臂應包含酶切位點，同樣以 PKM2 基因為例。其上下游引物分別為：
設計好引物后，通過 PCR 方法擴增目的基因，膠回收后的產物與載體酶切回收產物重組即可。
3. 轉化，涂板，挑單克隆，測序。
4. 質粒構建成功后即可轉染觀察是否能在細胞中表達。
以上就是通過慢病毒包裝體系在細胞中過表達基因的方法，此外還應注意幾點：
1. 在構建質粒時，zui好可以加入 GFP 標簽，這樣可以通過熒光的方法觀察基因的表達情況，同時也有利于穩(wěn)定篩選。
如果過表達效率不高時，可以通過流式細胞術進行篩選，獲得帶 GFP 的陽性細胞，使之純度變高。
2. 在傳代的過程中，由于細胞不斷分裂，過表達的效果會不斷減弱，所以如果需要更高純度的陽性細胞，需要挑單細胞.