免疫熒光間接法測抗體法的原理和實驗步驟

免疫熒光試驗定義

一種免疫標記技術(shù)。用于檢測相應(yīng)抗原或抗體。即用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標本中的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散發(fā)出熒光，借此對標本中的抗原進行鑒定或定位。

⑴基本原理

染色程序分為兩步，第一步，用未知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果第一步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標記的抗球蛋白抗體就會和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)合，從而可鑒定未知抗體。

⑵試劑與儀器

磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

熒光標記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋。

搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）

熒光顯微鏡

玻片架

濾紙

37℃溫箱等。

⑶實驗步驟

1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。

2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。

3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩。

4）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。

5）將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。

6）重復(fù)操作3。

7）取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。

8）熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。

⑷注意事項

1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。

2）每次試驗時 ，需設(shè)置以下三種對照：

① 陽性對照：陽性血清+熒光標記物

② 陰性對照：陰性血清+熒光標記物

③ 熒光標記物對照：PBS+熒光標記物

3. 已知抗原標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。

4. 所滴加的待檢抗體標本或熒光標記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色 。